王潔 馬委委 司晨琛 周炳榮 駱丹

[摘要]目的：探討miR-4655-3p在中波紫外線旁觀者效應(yīng)中的作用。方法：使用miR-4655-3p 抑制劑（inhibitor）或其對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照（negative control，NC）轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞（HSFs）后，對(duì)不同組HSFs進(jìn)行UVB（60mJ/cm2）單次照射，照光后24h取細(xì)胞培養(yǎng)上清液與正常HSFs共孵育48h，分別測(cè)定細(xì)胞增值率、氧化損傷水平及凋亡率。結(jié)果：inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-4655-3p相對(duì)表達(dá)量較NC轉(zhuǎn)染組明顯降低（P<0.05）;照光后，inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)上清液及該上清液孵育的HSFs中miR-4655-3p的相對(duì)表達(dá)量較NC轉(zhuǎn)染組顯著降低（P<0.05）;與NC組旁觀者細(xì)胞相比，Inhibitor組旁觀者細(xì)胞的增殖率增加，氧化損傷水平及凋亡率減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：miR-4655-3p在中波紫外線旁觀者效應(yīng)中發(fā)揮作用，抑制其表達(dá)可在一定程度上減弱紫外線旁觀者效應(yīng)。

[關(guān)鍵詞]miRNA;成纖維細(xì)胞;紫外線;旁觀者效應(yīng);氧化損傷;凋亡

[中圖分類號(hào)]R329.2? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2019）04-0068-03

Abstract： Objective? To investigate the role of miR-4655-3p in UVB-radiation induced bystander effects（UVB-RIBE）. Methods? HSFs transfected with miR-4655-3p inhibitor or NC were exposed to 60mJ/cm2 single UVB radiation. 24h after UVB radiation， the supernatant were transfered to normal HSFs and remained for 48h. Subsequently， cell proliferation rate， oxidative damage and apoptosis rate of recipient cells were measured. Results? The relative expression of miR-4655-3p in the inhibitor transfected cells were lower than the NC transfected cells. After UVB radiation， the relative expression of miR-4655-3p in the inhibitor transfected cells， their supernatant and the supernatant cultured bystander cells were lower than the corresponding NC transfected groups. The cell proliferation rate of bystander cells from inhibitor group was higher than bystander cells from NC group. Besides， the oxidative damage and apoptosis rate of bystander cells from inhibitor group was lower than bystander cells from NC group. All the data were statistically significant（P<0.05）. Conclusion? miR-4655-3p plays a role in UVB bystander effect. The down-regulation of miR-4655-3p inhibits UVB bystander effect to some extent.

Key words： miRNA; fibroblasts; ultraviolet; bystander effects; oxidative damage; apoptosis

日光紫外線是造成皮膚光老化的重要因素，長(zhǎng)期暴露于紫外線下會(huì)引起皮膚中多種細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生變化。目前認(rèn)為紫外線旁觀者效應(yīng)在紫外線不良反應(yīng)的病理進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用。紫外線旁觀者效應(yīng)是指未受輻射細(xì)胞發(fā)生與直接受輻射細(xì)胞類似的光損傷反應(yīng)，包括氧化損傷、基因突變、基因組不穩(wěn)定，細(xì)胞凋亡等[1]。研究表明，旁觀者效應(yīng)由細(xì)胞間間隙連接和分泌因子構(gòu)成的細(xì)胞間通訊引起[2]。筆者先前的實(shí)驗(yàn)通過使用基因芯片和實(shí)時(shí)定量PCR鑒定了中波紫外線輻射后差異表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-4655-3p在受照射的細(xì)胞、輻射細(xì)胞培養(yǎng)上清液中及其上清液培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)顯著升高。鑒于已有部分miRNA被證明在旁觀者效應(yīng)中扮演著重要角色[3-4]，筆者推斷miR-4655-3p在紫外線旁觀者效應(yīng)中發(fā)揮一定作用。本實(shí)驗(yàn)通過使用miR-4655-3p抑制劑下調(diào)中波紫外線照射后miR-4655-3p的表達(dá)，進(jìn)一步研究miR-4655-3p在紫外線輻射旁觀者效應(yīng)中的作用。

1? 材料和方法

1.1 HSFs的分離與培養(yǎng)：取健康成年男性的包皮組織，將包皮置于碘伏中浸泡6min。使用含10%青-鏈霉素的PBS溶液，快速反復(fù)沖洗包皮組織至無血跡，使用眼科剪仔細(xì)剪去皮下組織后加入適量0.25% Dispase酶消化液，并在4℃冰箱中消化18h。分離表、真皮組織后取真皮部分，加入適量0.1%膠原酶I消化液，并在37℃培養(yǎng)箱中消化2h。加入等量含10%胎牛血清（杭州四季青公司）及1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）終止反應(yīng)。使用200目尼龍網(wǎng)過濾，過濾液在1 500rpm下離心5min，棄上清，加入全培并輕輕吹打混勻，轉(zhuǎn)移至25cm2培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞處理：HSFs于處理前1d以50%的密度均勻種植于6孔板中。轉(zhuǎn)染試劑、miR-4655-3p inhibitor及inhibitor陰性對(duì)照購(gòu)于廣州銳博生物科技有限公司，根據(jù)說明書配制100nM的轉(zhuǎn)染混合液，并在室溫下放置10min。小心將轉(zhuǎn)染混合液滴入細(xì)胞培養(yǎng)上清中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后刷新培養(yǎng)基并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行單次60mJ/cm2 UVB照射，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。將此細(xì)胞培養(yǎng)上清加入正常HSFs中培養(yǎng)48h。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR：使用Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）提取總RNA。用莖環(huán)法進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄，U6作為miRNA的內(nèi)參。使用TB Green嵌合熒光試劑（日本TaKaRa公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。PCR程序使用StepOnePlusTM實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)，用2-△△Ct值比較分析數(shù)據(jù)。

1.4 細(xì)胞增殖率測(cè)定：96孔板中的細(xì)胞用轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清培養(yǎng)48h后，去除上清并用PBS清洗3遍。每孔中加入100?l培養(yǎng)基與10?l CCK8溶液（日本Dojindo公司）并混勻。在培養(yǎng)箱中避光孵育1.5h后使用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度。

1.5 氧化損傷水平測(cè)定：6孔板中的細(xì)胞用轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清培養(yǎng)48h后，去除上清并用PBS清洗3遍。按照1：500的比例用裸培稀釋DCFH-DA（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），每孔中加入1ml混合液，于培養(yǎng)箱中避光孵育20min。用裸培洗滌3次后使用熒光顯微鏡觀察，或收集細(xì)胞后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCF熒光強(qiáng)度。

1.6 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)：6孔板中的細(xì)胞用轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清培養(yǎng)48h后，去除細(xì)胞上清并用PBS清洗3遍。收集細(xì)胞用200?l緩沖液重懸，加入3?l Annexin V-FITC及3?l PI后輕柔渦旋混勻，室溫避光孵育10min后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，行t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 inhibitor轉(zhuǎn)染下調(diào)UVB照射后miR-4655-3p的表達(dá)：inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞miR-4655-3p相對(duì)表達(dá)量（0.5279±0.031）顯著低于NC轉(zhuǎn)染組（1.0±0.1）;細(xì)胞轉(zhuǎn)染后照光并培養(yǎng)24h后，inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中（0.4400±0.079）及上清液中（0.3295±0.044）miR-4655-3p的相對(duì)表達(dá)量較NC轉(zhuǎn)染組（1.0±0.1）顯著降低;inhibitor轉(zhuǎn)染組上清液培養(yǎng)48h后，旁觀者細(xì)胞中miR-4655-3p的相對(duì)表達(dá)量（0.5664±0.072）較NC組上清液培養(yǎng)的旁觀者細(xì)胞（1.0±0.1）顯著降低。以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 miR-4655-3p的下調(diào)對(duì)旁觀者細(xì)胞增殖率的影響：使用OD值表示細(xì)胞增殖水平，inhibitor組旁觀者細(xì)胞的增殖率（0.8697±0.016）高于NC組旁觀者細(xì)胞（0.7911±0.012），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 miR-4655-3p的下調(diào)對(duì)旁觀者細(xì)胞氧化損傷水平的影響：使用熒光顯微鏡觀察，可見inhibitor組旁觀者細(xì)胞的熒光亮度低于NC組旁觀者細(xì)胞。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCF平均熒光強(qiáng)度，inhibitor組旁觀者細(xì)胞的熒光強(qiáng)度（112.5±13.44）顯著低于NC組旁觀者細(xì)胞（171.9±7.38），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 miR-4655-3p的下調(diào)對(duì)旁觀者細(xì)胞凋亡水平的影響：流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，inhibitor組旁觀者細(xì)胞的凋亡率（14.82±2.54）較NC組旁觀者細(xì)胞（27.70±1.97）減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3? 討論

旁觀者效應(yīng)是一種已經(jīng)被充分證明的現(xiàn)象，其中由輻射引起的部分稱為輻射誘導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)。目前研究證明，輻射誘導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)由輻射細(xì)胞與旁觀者細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊引起，這種通信方式包括細(xì)胞間連接及可溶性因子等。

miRNA是一種長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)結(jié)合調(diào)節(jié)其表達(dá)[5]。據(jù)報(bào)道，miRNA可參與許多生理和病理過程，包括細(xì)胞周期、免疫反應(yīng)、生物代謝，致癌作用等[6]。最近，miRNA已被證明是參與旁觀者效應(yīng)的潛在介質(zhì)[3-4]。Tian等[7]人研究認(rèn)為miR-21通過調(diào)節(jié)SOD2促進(jìn)了α照射的HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞誘導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)。然而Hu等[8]人證實(shí)miR-663通過反饋模式靶向TGF-β1抑制輻射誘導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)。這些研究暗示miRNA在旁觀者效應(yīng)中發(fā)揮作用，且這些作用是多方面的，需要進(jìn)一步研究單個(gè)miRNA在旁觀者效應(yīng)中的功能及其作用于旁觀者細(xì)胞的途徑。作為RNA的一種，miRNA易被RNA酶降解，細(xì)胞外miRNA通過結(jié)合高密度脂蛋白[9]，與Ago2形成蛋白質(zhì)復(fù)合物[10]或被包裝到細(xì)胞外囊泡中[11]而避免被降解，這些miRNA統(tǒng)稱為分泌型miRNA。其中，由于具有特異性轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞的能力，外泌體miRNA的功能得到了很多關(guān)注。已經(jīng)報(bào)道了其在多方面的功能，例如參與腫瘤的發(fā)生[12]，在疾病中發(fā)揮促進(jìn)或保護(hù)作用[13-14]并充當(dāng)臨床生物標(biāo)志物[15]。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)使用基因芯片篩選出了許多中波紫外線輻射細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA。通過進(jìn)一步檢測(cè)輻射細(xì)胞培養(yǎng)上清液中miRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了一些與輻射細(xì)胞中呈現(xiàn)相同表達(dá)趨勢(shì)的miRNA，其中miR-4655-3p表達(dá)顯著增高。使用輻射細(xì)胞培養(yǎng)上清液孵育正常HSFs，出現(xiàn)類似直接受輻射細(xì)胞的光損傷效應(yīng)，說明這些上清液中有引起旁觀者效應(yīng)的介質(zhì)。結(jié)合既往關(guān)于miRNA及旁觀者效應(yīng)間的研究，筆者推測(cè)miR-4655-3p是起作用的介質(zhì)之一。本實(shí)驗(yàn)使用inhibitor下調(diào)UVB輻射后的miR-4655-3p表達(dá)，發(fā)現(xiàn)抑制miR-4655-3p后，旁觀者細(xì)胞的光損傷效應(yīng)在一定程度上減弱。這些結(jié)果表明UVB輻射過后，miR-4655-3p的升高促進(jìn)了紫外線旁觀者效應(yīng)。

本文雖然證明了miR-4655-3p在旁觀者效應(yīng)中起促進(jìn)作用，但不足之處在于并未闡明miR-4655-3p在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制及其引起旁觀者效應(yīng)的分子機(jī)理。同時(shí)，有研究強(qiáng)調(diào)了miRNA之間的相互作用[16]，這不禁讓筆者思考，紫外線旁觀者效應(yīng)的機(jī)制中是否也存在類似作用，這些問題都有待于進(jìn)一步的研究及探討。隨著對(duì)miRNA和紫外線旁觀者效應(yīng)的進(jìn)一步了解，這些研究可能為紫外線防護(hù)和紫外線相關(guān)疾病的治療提供新的見解。

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[收稿日期]2019-01-05