侯玉蘭，朱黎黎，汪志學(xué)，常 琳△

(1.重慶市璧山區(qū)人民醫(yī)院檢驗科,重慶 402760；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科，重慶 402760)

乳腺癌是當(dāng)今危害女性健康的第一大腫瘤，其發(fā)病率居女性惡性腫瘤之首[1]。目前我國乳腺癌發(fā)病率為21.6/10萬，較10年前增長了近一倍[2]。近年來隨著醫(yī)療水平的提高，乳腺癌的總體五年生存率有所提高，但某些分子類型乳腺癌的預(yù)后仍不盡如人意，尤其是基底細(xì)胞型乳腺癌[3]。乳腺癌的預(yù)后取決于其分子類型與TNM分期，尋找可靠、穩(wěn)定且無創(chuàng)的早期篩查指標(biāo)無疑可為乳腺癌患者的治療贏得時間，對預(yù)后的提供具有重要意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)，多種長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)在乳腺癌患者中存在異常表達(dá)，可通過表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后翻譯等多種途徑參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移等過程[4]，這些lncRNAs包括lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT等。本研究通過對245例乳腺癌患者與250例健康女性的血漿lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表達(dá)水平進(jìn)行比較分析，旨在探究三者對乳腺癌的診斷價值及其與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系，以期為乳腺癌的臨床診療提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年3月至2017年12月在重慶市璧山區(qū)人民醫(yī)院初次確診的乳腺癌患者245例(病例組)。病例組納入標(biāo)準(zhǔn)為：(1)經(jīng)CT結(jié)合病理學(xué)確診為乳腺癌；(2)入院前未經(jīng)治療。其中Luminal A 型83例、Luminal B型 81例、人類表皮生長因子受體2(HER2)過表達(dá)型33例、基底細(xì)胞型48例，Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌137例、Ⅲ～Ⅳ乳腺癌108例?；颊咂骄挲g(45.56±3.23)歲。乳腺癌分子分型的依據(jù)來自術(shù)中切除的腫瘤組織的免疫組化結(jié)果。乳腺癌的分期參照美國腫瘤聯(lián)合會(AJCC)第8版乳腺癌分期系統(tǒng)[5]。對照組為同期在本院行體檢的健康女性250例，平均年齡(44.87±3.76)歲。由研究人員記錄兩組研究對象的年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、吸煙史、飲酒史等基本信息。所有研究對象均排除乳腺良性結(jié)節(jié)、血液系統(tǒng)疾病、急慢性感染、心血管疾病、其他的良惡性腫瘤及自身免疫性疾病等。本研究的開展經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有納入對象均簽署了項目知情同意書。

1.2血漿 lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表達(dá)水平檢測 研究對象均禁食10 h以上，次日清晨由專業(yè)醫(yī)護(hù)人員使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝采血管抽取靜脈血10 mL，血液標(biāo)本在1 h內(nèi)于4 ℃條件下以12 000 g離心力離心15 min以去除血細(xì)胞。收集上層液體，按照血漿RNA提取試劑盒(中國Bioteke公司)說明書步驟進(jìn)行血漿總RNA提取。取上述提取的RNA，使用去除基因組逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國Takara公司)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實時熒光定量PCR(qPCR)法檢測血漿lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT及內(nèi)參基因GAPDH表達(dá)水平。反應(yīng)體系為：Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，DEPC水6.4 μL。熒光定量PCR循環(huán)條件：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45個循環(huán)，每組設(shè)置2個復(fù)孔。檢測過程中所用引物序列如下：HOTTIP上游引物：5′-AGT GTG TCA TAG AGC TTC CTG TTT CAT CTC CCA GT-3′下游引物：5′-TGG AAC CAG GCC CCA GGG AAT CTT TCA GCT GCA TT-3′；ATB 上游引物：5′-TAC AAC CAC TGC ACT ACC TG-3′，下游引物：5′-TGG AAT GCT TGA AGG CTG CT-3′； MIAT上游引物：5′-CGA ACG AGA GGA CCG AAG-3′，下游引物：5′-GCC AAG TTC TAG ATA AGC -3′；GAPDH 上游引物：5′-GGG AGC CAA AAG GGT CAT-3′，下游引物：5′-GAG TCC TTC CAC GAT ACC AA-3′；采用2-ΔΔCt法計算lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT的相對表達(dá)量，△Ct值=目的基因Ct值-GAPDH Ct值。

2 結(jié) 果

2.1兩組研究對象的基本臨床信息 研究對象的基本臨床信息見表1。病例組與對照組在年齡、BMI、吸煙史、飲酒史等方面的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

表1 病例組和對照組臨床基本信息的比較

2.2兩組研究對象的血漿 lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表達(dá)水平 病例組的血漿lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表達(dá)水平均高于對照組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 病例組和對照組血漿lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT相對表達(dá)水平的比較

2.3血漿 lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表達(dá)水平與乳腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系 血漿lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表達(dá)水平與乳腺癌患者的年齡、BMI、吸煙與否、飲酒與否等因素?zé)o關(guān)(P>0.05)，而與乳腺癌的TNM分期、分子分型顯著相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 血漿 lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表達(dá)水平與乳腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系(-log)

2.4ROC曲線分析 ROC曲線分析顯示，血漿lncRNA HOTTIP、ATB、MIAT在區(qū)分乳腺癌與健康人群的AUC分別為：0.784(95%CI：0.701～0.866，P<0.001)、0.887(95%CI：0.822～0.951，P<0.001)、0.913(95%CI：0.855～0.971，P<0.001)，靈敏度和特異度分別為：63.8%/89.3%、79.7%/91.7%、87.1%/92.8%。當(dāng)聯(lián)合血漿lncRNA HOTTIP、ATB、MIAT時，區(qū)分食管癌與健康人群的AUC為0.977(95%CI：0.902～0.998，P<0.001)，靈敏度為85.5%，特異度為97.6%，見圖1。

2.5風(fēng)險評估 多元Logistic回歸分析結(jié)果，見表4。單因素分析顯示，血漿高lncRNA HOTTIP、ATB、MIAT水平是乳腺癌發(fā)病的危險因素(P<0.05)；多因素分析顯示，在校正年齡、BMI、吸煙史、飲酒史等因素的影響后，血漿高lncRNA HOTTIP、ATB、MIAT水平仍是乳腺癌發(fā)病的獨立危險因素(P<0.05)。

圖1 ROC曲線分析

單因素分析OR(95%CI)P多因素分析OR(95%CI)PHOTTIP1.32(1.09～2.31)0.0371.12(1.03～1.34)0.048ATB4.61(2.18～7.33)<0.0014.77(1.47～6.08)<0.001MIAT5.38(1.39～8.91)<0.0013.51(1.53～5.72)0.001

3 討 論

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，約占女性全部惡性腫瘤的22.9%，嚴(yán)重威脅女性身心健康[6]。中國女性的乳腺癌發(fā)病率雖低于全球發(fā)病率，但隨著近年來人們生活方式及生育觀念的改變，乳腺癌的發(fā)病率有逐年增高趨勢[7]。目前乳腺癌的治療效果并不樂觀，采用的主要治療方式包括單純手術(shù)治療、抗腫瘤藥物治療及放射治療[8]。晚期患者接受手術(shù)治療后，雖可提高患者的五年生存率，但卻嚴(yán)重影響了女性的后期生活，甚至對女性心理健康也造成了一定的影響[9]。由于乳腺癌治療方式的選擇及預(yù)后主要取決于腫瘤的TNM分期與分子分型[7,10]，而目前尚無可靠的早期篩查生物學(xué)指標(biāo)，因而尋找有效、穩(wěn)定且無創(chuàng)的早期篩查指標(biāo)對改善患者生存質(zhì)量，提高患者預(yù)后具有重要意義。

近年來，關(guān)于lncRNAs在乳腺癌領(lǐng)域的相關(guān)功能學(xué)研究逐漸成為新的熱點。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了近10種lncRNAs與乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等過程有關(guān)。例如，YANG等[11]對460例乳腺癌患者的一項薈萃分析結(jié)果表明，lncRNA HOTTIP表達(dá)水平與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、TNM分期等密切相關(guān)，且高水平的lncRNA HOTTIP提示更差的臨床預(yù)后。隨后研究發(fā)現(xiàn)其可能的機(jī)制lncRNA HOTTIP可誘導(dǎo)腫瘤組織高表達(dá)HOXA11，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[12]。LncRNA ATB也被證實參與乳腺癌的發(fā)病過程。SHI等[13]利用永生化乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行體外實驗的結(jié)果表明，LncRNA ATB可通過TGF-β途徑誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的耐藥，并增強(qiáng)其侵襲能力。NIKPAYAM等[14]對50對乳腺癌及癌旁組織中LncRNA ATB的表達(dá)進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，癌組織中LncRNA ATB表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，提示LncRNA ATB對鑒別診斷乳腺癌具有潛在價值。除lncRNA HOTTIP與ATB外，近年來關(guān)于LncRNA MIAT與乳腺癌的研究也有一定進(jìn)展。例如，LUAN等[15]的體外實驗證實，LncRNA MIAT可作為內(nèi)源競爭RNA取代miR-155-5p并上調(diào)DUSP7表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)病。ALIPOOR等[16]發(fā)現(xiàn)，LncRNA MIAT在乳腺癌等多種腫瘤組織中均呈高表達(dá)狀態(tài)，而靶向抑制LncRNA MIAT則可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，并降低其遷移能力。上述研究結(jié)果提示，lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT可通過多種途徑參與乳腺癌的發(fā)病過程，而三者的異常表達(dá)可能為乳腺癌的早期診斷提供線索，但目前國內(nèi)外尚無關(guān)于上述3種LncRNAs與乳腺癌診斷的相關(guān)報道。

在本次研究中，首次探究了血漿lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT對乳腺癌的診斷價值，并分析了三者與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明，聯(lián)合三項指標(biāo)診斷乳腺癌的特異度高達(dá)97.6%，顯著高于單項指標(biāo)靈敏度，表明聯(lián)合檢測血漿lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT診斷乳腺癌具有可行性，可考慮在臨床推廣使用。此外，本研究再次證實，lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表達(dá)水平與乳腺癌的分子類型、TNM分期顯著相關(guān)，該結(jié)論與前期國外研究結(jié)果相一致，表明lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表達(dá)水平對乳腺癌的預(yù)后具有一定預(yù)測作用。由于本次研究收集的樣本數(shù)量有限，未來仍需更多大樣本多中心研究對本研究的結(jié)論進(jìn)行驗證。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)血漿lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT對乳腺癌的診斷、發(fā)病風(fēng)險評估及預(yù)后評估中具有潛在價值，有望為乳腺癌的臨床診療提供新思路。