李金蓉，阮亮亮,2,3△，楊文初

(1.上海楓林醫(yī)藥醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司特檢部，上海 200031；2.上海醫(yī)藥臨床研究中心，上海 200031；3.上海生物樣本庫(kù)工程技術(shù)研究中心，上海 200031)

脂溶性維生素是人體必需的營(yíng)養(yǎng)成分，在人體的生理、病理上起著至關(guān)重要的作用。越來(lái)越多的研究證據(jù)表明，脂溶性維生素A、D、E與人體多種生理代謝性疾病相關(guān)聯(lián)。最近的大量研究表明，維生素D缺乏除會(huì)引起傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)到的兒童佝僂病外[1]，還與冠心病，糖尿病，小兒頭疼，癌癥等眾多疾病關(guān)系密切[2-5]。維生素D的檢測(cè)已成為目前最為活躍的疾病標(biāo)志物檢測(cè)領(lǐng)域之一。維生素A除與視力的發(fā)育及功能，性腺功能等有關(guān)外[6-7]，最新研究表明，維生素A在慢性的移植抗宿主疾病中具有改善皮膚的纖維化的功效[8]。維生素E作為抗氧化劑，普遍認(rèn)為具有抗衰老的作用，最新發(fā)現(xiàn)維生素E缺乏也會(huì)導(dǎo)致卵巢激素的缺乏，從而會(huì)引起相關(guān)的疾病[9-10]。目前，檢測(cè)維生素的方法主要有免疫分析法、高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用LC-MS/MS法等[11-13]。LC-MS/MS方法相比于免疫分析法具有特異性和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。因此，液質(zhì)聯(lián)用的方法已經(jīng)廣泛被運(yùn)用在測(cè)量生物標(biāo)記物方面?，F(xiàn)今，已經(jīng)有部分研究運(yùn)用液質(zhì)聯(lián)用的方法同時(shí)分析脂溶性維生素A、D、E[14-16]。這些方法，在分析時(shí)間、靈敏度、方法成本等方面尚有諸多不足。此外，這些維生素是人血清內(nèi)源物質(zhì)，無(wú)法找到不含這些分析物的人空白血清配制校正標(biāo)準(zhǔn)做定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而增加了一般方法的臨床應(yīng)用難度。本文首次提出并驗(yàn)證了以代替基質(zhì)為基礎(chǔ)的LC-MS/MS法，在5 min時(shí)間里完成了四種成分的同時(shí)準(zhǔn)確定量，節(jié)省了試劑成本和時(shí)間成本。通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，證明了方法適用于人血清中25-羥基維生素D2(25OHVD2)、25-羥基維生素D3(25OHVD3)、維生素A、維生素E的同時(shí)定量。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 液相色譜為L(zhǎng)C20AD XR HPLC pumps 及SIL-20AC XR 自動(dòng)進(jìn)樣器；質(zhì)譜為AB Sciex QTrap5500型質(zhì)譜儀。分析天平為賽多利斯公司CPA225D型；氮吹儀為Zymark公司Turbo Vap型；多管渦旋振蕩器為Scientific Industry公司產(chǎn)品；離心機(jī)為Thermoscientific公司CL31R型。25OHVD2、25OHVD3、2H3-25-Hydroxy維生素D2、2H6-25-Hydroxy維生素D3購(gòu)買自IsoSciences公司；維生素A購(gòu)買自Sigma-Aldrich；維生素E購(gòu)買自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；2H6-Retinol，購(gòu)買自ISOREAG公司；維生素E-d6：購(gòu)買自Toronto Research Chemicals公司。試劑如環(huán)己烷、甲醇、甲酸，甲酸銨均購(gòu)買自sigma-Aldrich公司。水為Millipore生產(chǎn)雙蒸水。

1.2方法

1.2.1工作液的配制 四種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液(SWS1～SWS8)及最低檢測(cè)線、低、中、高4個(gè)水平的質(zhì)控工作液(QWS-LL、QWS-L、QWS-M、QWS-H)，按表1中濃度由高濃度逐級(jí)溶劑稀釋配制。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液和質(zhì)控工作液名稱和濃度(ng/mL)

1.2.2代替基質(zhì)及其效能的平行試驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.2.1代替基質(zhì)及其配制按本實(shí)驗(yàn)室自行開發(fā)的方法配制 代替基質(zhì)由實(shí)驗(yàn)室易得的化學(xué)品配制而成。

1.2.2.2平行試驗(yàn)驗(yàn)證 (1)取6份至少6個(gè)不同來(lái)源的混合血清，添加工作液，對(duì)得到的樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)加入法分析，外推得到本底濃度，從而得到各點(diǎn)的理論濃度，此數(shù)據(jù)用作為濃度的參照值。(2)用代替基質(zhì)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)上述樣品進(jìn)行定量，測(cè)得濃度；(3)計(jì)算代替基質(zhì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度，從而驗(yàn)證代替基質(zhì)的可行性。

1.2.3質(zhì)控樣品的配制

1.2.3.1分析批代替基質(zhì)質(zhì)控的配制 分析批質(zhì)控樣品包括最低檢測(cè)線質(zhì)控(LLOQ)、低濃度質(zhì)控(LQC)、中濃度質(zhì)控(MQC)和高濃度質(zhì)控(HQC)4個(gè)水平，由表1中各質(zhì)控工作液25 μL依次加入到100 μL替代基質(zhì)中配制而成。每個(gè)分析批次均新鮮配制。

1.2.3.2血清質(zhì)控樣品的配制 高血清質(zhì)控樣品(HQC-Sr)是將標(biāo)曲工作液中的最高濃度點(diǎn)以工作液∶血清=1∶20的比例加入血清中混勻所得。中血清質(zhì)控樣品(MQC-Sr)為血清樣品測(cè)試得到的本底濃度。

1.2.4樣品處理

1.2.4.1校準(zhǔn)曲線及批內(nèi)質(zhì)控品的處理方法 25 μL標(biāo)曲工作液，或代替基質(zhì)質(zhì)控工作液分別加入100 μL替代基質(zhì)中，加入200 μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻，加入900 μL環(huán)己烷，渦旋5 min，高速離心5 min；轉(zhuǎn)移800 μL上清至另一離心管，氮?dú)獯蹈桑患尤?00 μL 80%甲醇水溶液復(fù)溶，渦旋離心后，取上清進(jìn)樣分析。

1.2.4.2血清樣品的處理方法 25 μL甲醇加入100 μL血清樣本中，加入200 μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋10 s，加入900 μL環(huán)己烷，渦旋5 min，高速離心5 min；轉(zhuǎn)移800 μL上清至另一離心管，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?00 μL 80%甲醇水溶液進(jìn)行復(fù)溶，渦旋離心后，取上清進(jìn)樣分析。

1.2.5LC-MS/MS方法參數(shù) 實(shí)驗(yàn)使用APCI離子源，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)進(jìn)行選擇離子掃描定量，質(zhì)譜參數(shù)如下。霧化氣(Gas 1)：70 psi；噴霧電壓：3 V；氣簾氣(CUR)：25 psi；碰撞氣(CAD)：Medium；離子源溫度(TEM)：550 ℃。各化合物及其內(nèi)標(biāo)的過(guò)渡離子對(duì)如下，25OHVD3：383.4→365.3，25OHVD2：395.3→209.1，維生素A：269.0→93.0，維生素E：431.4→165.2；d3-25OHVD2：398.3→230.2，d6-25OHVD3：389.4→371.3，維生素E-d6：437.5→171.1，維生素A-d6：275.1→175.8。液相分離選用Thermo scientific公司Accucore色譜柱C18，50×2.1 mm，2.6 μm；流動(dòng)相A為0.2%甲酸-1 mmol/L甲酸銨甲醇溶液，流動(dòng)相B為0.2%甲酸-1 mmol/L甲酸銨水溶液；流速：0.5 mL/min；柱溫：40 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：4 ℃。洗脫步驟如下：0～1.5 min有機(jī)相比例從70%升至95%，保留1.8 min，然后在0.2 min時(shí)間內(nèi)升至100%有機(jī)相，保留1.6 min，之后回到初始有機(jī)相比例，停留0.5 min。最終在5 min時(shí)間里完成分析。代表性的圖譜見(jiàn)圖1。樣品濃度分別為25OHVD2:20 ng/mL,25OHVD3:80 ng/mL,維生素A:4 000 ng/mL,維生素E:12 000 ng/mL。

2 結(jié) 果

2.1代替基質(zhì)的可行性平行試驗(yàn)驗(yàn)證 如表2所示。內(nèi)源性物質(zhì)常規(guī)的定量方法為標(biāo)準(zhǔn)加入法，此測(cè)定結(jié)果在這里作為參照標(biāo)準(zhǔn)。用代替基質(zhì)所做的標(biāo)曲，得到相關(guān)系數(shù)r>0.990 0。用此標(biāo)曲定量標(biāo)準(zhǔn)添加法的樣品，得到的值與標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)比，以評(píng)價(jià)代替分析物的可用性。4種化合物的用替代基質(zhì)測(cè)定的偏差均在±20%以內(nèi)。由此證明所配制的替代基質(zhì)可以作為定量真實(shí)血清樣本的替代基質(zhì)，結(jié)果可靠。

2.2血清基底值測(cè)試 方法的可靠性必須通過(guò)真實(shí)的血清質(zhì)控品來(lái)驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)中以替代基質(zhì)配制四個(gè)水平LLOQ、LQC、MQC、HQC的質(zhì)控和兩個(gè)水平的真實(shí)血清質(zhì)控MQC-Sr(混合血清本底值)/HQC-Sr(標(biāo)準(zhǔn)加入一定量的混合血清值)各平行6份，按照樣品前處理方法處理。上機(jī)測(cè)試得到血清MQC/HQC的實(shí)測(cè)濃度值。此值作為后期日內(nèi)及日間準(zhǔn)確度與精密度及穩(wěn)定性測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)值。加入此兩個(gè)水平的質(zhì)控樣本的目的一是為了說(shuō)明方法適用于臨床真實(shí)樣本的測(cè)試，另一方面也說(shuō)明了混合了不同來(lái)源的人血清樣本中幾乎不含對(duì)定量有干擾的物質(zhì)。說(shuō)明方法具有特異性。各化合物血清本底測(cè)試值由于篇幅限制未呈現(xiàn)。

2.3日內(nèi)及日間準(zhǔn)確度與精密度 為了考察方法的日內(nèi)及日間準(zhǔn)確度與精密度，配制了6個(gè)水平的質(zhì)控品考察實(shí)測(cè)值與理論值之間的偏差。分別在3個(gè)不同的分析批及不同天對(duì)6個(gè)水平的質(zhì)控品進(jìn)行比較。根據(jù)測(cè)試結(jié)果，準(zhǔn)確度與精密度的偏差均在±20%以內(nèi)，符合生物樣本分析的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。見(jiàn)表3。

圖1 4種化合物在5 min的LC-MS/MS的代表性色譜圖

樣品名稱標(biāo)準(zhǔn)加入后的理論值A(chǔ)(ng/mL)25OHVD225OHVD3維生素A維生素E替代基質(zhì)標(biāo)曲測(cè)量值B(ng/mL)25OHVD225OHVD3維生素A維生素E使用替代基質(zhì)的誤差(%)25OHVD225OHVD3維生素A維生素ESAS 01.2532.24 7807 3101.1125.64 5008 640-11.1-20.1-5.918.2SAS 146.30212.013 80034 30044.90202.012 90034 200-2.9-4.8-6.4-0.3SAS 236.30172.011 80028 20037.70146.010 80032 2004.0-15.2-8.313.7SAS 326.30132.09 78022 30028.60123.09 16023 7009.0-7.0-6.46.2SAS 413.8082.27 28014 80015.5065.77 36014 80012.7-20.11.1-0.1SAS 53.7542.25 2808 8104.0338.54 9109 2007.5-8.9-7.14.4

2.4穩(wěn)定性

2.4.1儲(chǔ)備液穩(wěn)定性 實(shí)驗(yàn)中考察了儲(chǔ)備液在-20 ℃冰箱1個(gè)月的穩(wěn)定性，結(jié)果符合新舊比對(duì)偏差在±10%以內(nèi)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。此外，還考察了儲(chǔ)備液在室溫放置6 h的穩(wěn)定性，結(jié)果也符合差異±10%以內(nèi)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明使用的儲(chǔ)備液在一個(gè)月的時(shí)間內(nèi)是保持穩(wěn)定的，且室溫放置6 h及以內(nèi)不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。

2.4.2工作液的室溫穩(wěn)定性 接近LLOQ的濃度點(diǎn)放置在室溫6 h，與新鮮配制的相同濃度點(diǎn)比較，結(jié)果符合偏差在±10%以內(nèi)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)中使用的工作液自開始驗(yàn)證配制后儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱到完成驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)1個(gè)月的時(shí)間里保持穩(wěn)定，說(shuō)明工作液在1個(gè)月的時(shí)間里是穩(wěn)定的。由此，方法中使用的工作液放置在室溫 6 h及以內(nèi)，以及儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱1個(gè)月時(shí)間均不會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。

2.4.3短期穩(wěn)定性 考察替代基質(zhì)質(zhì)控LQC和HQC及血清質(zhì)控MQC-Sr和HQC-Sr共四個(gè)水平在室溫放置24 h的穩(wěn)定性。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，250HVD2，25OHVD3及維生素E三種成分的替代基質(zhì)質(zhì)控和血清質(zhì)控在室溫放置24 h均穩(wěn)定。維生素A替代基質(zhì)質(zhì)控在室溫放置24 h不穩(wěn)定，每次分析需要新鮮配制。而血清質(zhì)控是穩(wěn)定的，說(shuō)明真實(shí)樣本即使在室溫放置24 h依然呈穩(wěn)定狀態(tài)。限于篇幅，數(shù)據(jù)未列出。為了考察維生素A替代基質(zhì)質(zhì)控品的穩(wěn)定性狀態(tài)，接著又考察了其2、4、6 h,穩(wěn)定性。由數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，維生素A在2 h里都會(huì)有近30%的降解，進(jìn)一步說(shuō)明維生素A的替代基質(zhì)質(zhì)控需新鮮制備，不適用于室內(nèi)保存。

2.4.4凍融穩(wěn)定性 考察了血清MQC-Sr和HQC-Sr兩個(gè)濃度水平，將早先配制好儲(chǔ)存在冰箱的HQC-Sr及MQC-Sr放置室溫解凍后，再次存儲(chǔ)回-20 ℃冰箱冷凍至少12 h以上再次解凍，依次循環(huán)3次考察其經(jīng)過(guò)3次凍融循環(huán)后濃度與理論濃度之間的偏差。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，得知血清在經(jīng)過(guò)3個(gè)凍融循環(huán)后，依然可以保持穩(wěn)定。不影響檢測(cè)結(jié)果。滿足生物分析方法學(xué)±20%以內(nèi)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。限于篇幅，數(shù)據(jù)未列出。

2.4.5長(zhǎng)期穩(wěn)定性 考察了真實(shí)的血清質(zhì)控品放置在-20 ℃冰箱1個(gè)月的穩(wěn)定性狀態(tài)。由于短期穩(wěn)定性考察中維生素A替代基質(zhì)質(zhì)控品在室溫放置不穩(wěn)定，這里還考察了替代基質(zhì)質(zhì)控品在-20 ℃冰箱放置3 d的穩(wěn)定性。由表4得到，血清質(zhì)控在-20 ℃冰箱放置1個(gè)月的時(shí)間里仍然穩(wěn)定，且4種成分的替代基質(zhì)質(zhì)控放置在-20 ℃冰箱3 d時(shí)間里也是穩(wěn)定的。

表3 日內(nèi)及日間準(zhǔn)確度與精密度(%)

表4 4種化合物的長(zhǎng)期穩(wěn)定性(n=6)

續(xù)表4 4種化合物的長(zhǎng)期穩(wěn)定性(n=6)

3 討 論

同時(shí)高效、精確定量人血清中25OHVD2、25OHVD3、維生素A、維生素E四種脂溶性維生素是一挑戰(zhàn)性課題。原因一，四種物質(zhì)在血清中含量分布很寬，從25OHVD2的納克級(jí)以下，到維生素E的微克級(jí)以上，因此要求方法的線性范圍寬。本方法即可靈敏地定量到低濃度的25OHVD2，也可檢測(cè)到高濃度維生素E；原因二，作為內(nèi)源性化合物的空白基質(zhì)的不可得到性。市面上尚無(wú)包含這四種維生素的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品，即使有，方法的成本也會(huì)很高，直接影響方法的廣泛應(yīng)用性。對(duì)內(nèi)源性生物標(biāo)志物的定量，如果空白基質(zhì)無(wú)法得到，通常采取代替分析物或代替基質(zhì)法。以同位素為基礎(chǔ)的代替分析物法，盡管方法發(fā)展較容易，但成本較高，而且后續(xù)樣品分析因不可用標(biāo)曲直接定量而較麻煩。選用代替基質(zhì)法，一旦代替基質(zhì)的可用性得到證明，方法應(yīng)用到樣品分析則如常規(guī)定量分析一樣，無(wú)附加步驟。但代替基質(zhì)需反復(fù)篩選，以期其性能滿足分析要求。經(jīng)過(guò)大量篩選優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)室制得了一種易得且性能可靠的代替基質(zhì)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，其可用性得到證實(shí)。該方法使用了自配易得的替代基質(zhì)來(lái)制備校準(zhǔn)品和質(zhì)控品，縮減了成本，提高了經(jīng)濟(jì)效益，使得方法更加實(shí)用。其三是方法的靈敏度和樣品用量。由于25OHVD2的濃度很低，為達(dá)到準(zhǔn)確定量，一般報(bào)道的方法樣品用量都較大。而本方法只需100 μL血清就能達(dá)到較低的檢測(cè)限，完全滿足臨床樣本的分析要求，減輕了患者的痛苦。經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，證明了該方法具有靈敏度高、可靠、穩(wěn)定、耐用、快速等優(yōu)點(diǎn)。本方法適用于臨床樣本的分析。目前該方法已在本實(shí)驗(yàn)室服務(wù)于臨床樣品分析。