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(1.廣州市第二中學，廣東廣州 510080;2.中山大學公共衛(wèi)生學院,廣東省營養(yǎng)膳食與健康重點實驗室,廣東廣州 510080)

葡萄是世界上廣泛種植的水果之一,具有多種生物學功能,如抗菌、抗癌、抗氧化、抗炎、保護肝臟和保護心血管等[1-5],深受人們喜愛。此外,葡萄也常用于生產葡萄酒、葡萄汁等產品,工業(yè)生產中會產生大量葡萄皮、籽副產物。研究表明,葡萄皮、肉、籽中均含有豐富的植物化學物,尤其是多酚類、黃酮類化合物,如花色苷、白黎蘆醇、單寧和槲皮黃酮等,被認為是與葡萄生物學功能相關的活性成分[6-8]。這些天然活性成分具有作用效果強、毒副作用小等優(yōu)點,適合用于慢性病預防[9-10]。但不同品種葡萄及其不同部位可能具有不同的抗氧化活性和生物活性成分,而目前尚無研究對此進行系統(tǒng)評價。

新疆是我國主要葡萄產地之一,在本研究中,選取產于新疆的11個鮮食葡萄品種作為研究對象,采用鐵還原能力試驗(FARP assay)和Trolox等效抗氧化能力試驗(TEAC assay)分別測定其皮、肉、籽的還原能力和自由基清除能力,用福林酚法測定其總酚含量(TPC),并分析FRAP、TEAC、TPC之間的關系,從而系統(tǒng)評價這11個鮮食葡萄品種抗氧化活性的特點及其主要活性成分。本研究結果將為居民膳食指導提供理論基礎,同時為優(yōu)良葡萄品種的培育和種植及其在功能食品工業(yè)中的開發(fā)利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

11個鮮食葡萄品種 包括珍珠黑提、珍珠青提、火焰葡萄、無籽露葡萄、紅提、巨峰葡萄、無籽紅提、無籽黑提、無籽青提、玫瑰香黑提、夏黑葡萄,采購于廣州市各超市和水果專賣店;2,2′-聯氮雙-(3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸)二銨鹽(2,2′-azinobis(3-ethylbenothiazoline-6-sulphonic acid)diammonium salt,ABTS)、2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-tri(2-pyridyl)-S-triazine,TPTZ)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid,Trolox)、福林酚試劑、沒食子酸 美國圣路易斯Sigma公司;四氫呋喃、甲醇、乙醚、乙酸乙酯 天津科密歐公司;冰醋酸、醋酸鈉、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、氫氧化鈉、鹽酸、抗壞血酸、六水三氯化鐵、七水硫酸亞鐵、過硫酸鉀、無水碳酸鈉、乙醇、正己烷 天津大茂公司。所用試劑均為分析純或色譜純。

XT-A400型粉碎機 永康市紅太陽機電有限公司;3-18K型臺式離心機 美國圣路易斯Sigma公司;DKZ-450B型恒溫振蕩水槽 上海森信試驗儀器有限公司;N-EVAP111型氮吹儀 德國柏林Oganomation Associates,Jnc公司;9030型電熱恒溫鼓風干燥箱 廣州科橋試驗技術設備有限公司;DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;722型分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 用雙蒸水沖洗葡萄去除果皮上的污物,待果皮表面水分在室溫下干燥后,將葡萄分離成皮、肉、籽三個部位,并用粉碎機研磨為均質。

1.2.3 水溶性部分提取 取步驟1.2.2中的殘留物,加入10 mL酸化甲醇(甲醇∶冰醋酸∶水=50∶3.7∶46.3/v∶v∶v),搖勻,30 ℃震蕩水浴30 min,4200×g離心10 min,收集上清;重復提取2次并混合,作為水溶性部分[11],儲存于-20 ℃冰箱,備用。

1.2.4 結合態(tài)部分提取 取步驟1.2.3中的殘留物,加入5 mL氫氧化鈉溶液(2 mol/L NaOH,10 mmol/L EDTA,1%抗壞血酸)水解,30 ℃震蕩水浴30 min,混合物加入鹽酸(6 mol/L HCl)酸化至pH=2左右,并加入5 mL正己烷,4200×g離心10 min分層后棄去有機相部分,重復2次以除去加堿水解釋放出來的脂肪酸;然后加入5 mL乙醚-乙酸乙酯混合溶劑(1∶1/v∶v)提取,4200×g離心10 min分層,收集有機相部分;重復提取2次并混合,然后用氮氣吹干溶劑,并用5 mL無水乙醇復溶,作為結合態(tài)部分[12],儲存于-20 ℃冰箱,備用。

1.2.5 水分含量測定 精確稱取研磨后樣品2.000 g于預先干燥至恒重的稱量皿中,放入電熱恒溫鼓風干燥箱中65 ℃烘干至恒重,計算樣品水分含量(Q),以百分比(%)表示。計算公式為:

Q(%)=(m1+M-m2)×100/M

式中:m1為稱量皿質量(g),M為樣品質量(g),m2為干燥恒重后稱量皿加樣品殘渣的總質量(g)。

1.2.6 鐵還原能力試驗(FRAP assay) 參照Benzie等[13]的方法進行FRAP試驗,略有改動。樣品溶液用雙蒸水適當稀釋,使最終吸光度落在標準曲線的線性范圍。取100 μL稀釋后樣品溶液加入到3 mL FRAP反應液中,在室溫下孵育4 min后用722型分光光度計在593 nm波長下測定吸光度,空白調零液為100 μL雙蒸水與3 mL FRAP反應液(孵育4 min)。應用0～2000 μmol/L FeSO4溶液作為參考標準繪制標準曲線,FRAP值換算成μmol Fe(II)/g 干重(DW)樣品。計算公式為:

FRAP=10-3×100×N×C×V/M(100-Q)(μmol Fe(II)/g DW)

通過百度指數中顯現的人群屬性發(fā)現，關注“親子游”用戶有以下特征：在性別上，64%的男性和36%的女性網絡用戶關注親子游，說明男性較女性更加關注親子游活動；在年齡上，30—39歲年齡段的用戶關注親子游活動最高，20—29歲、40—49歲的用戶分別占18%、14%，19歲及以下、50歲及以上的用戶僅占2%、3%，可見，中年人更加關注親子游活動，并且對親子游產品的旅游需求多樣化，通過網絡搜索獲取旅游信息是中年人旅游行為的特征之一。

式中:N為樣品溶液的稀釋倍數,C為樣品溶液吸光度對應的Fe(II)濃度(umol/L),V為樣品溶液總體積(mL),M為稱取樣品的質量(g),Q為樣品水分含量(%)。

1.2.7 Trolox等效抗氧化能力試驗(TEAC assay) 參照Re等[14]的方法進行TEAC試驗,略有改動。樣品溶液用雙蒸水適當稀釋,使其能夠抑制20%～80%的空白吸光度值(A)。取100 μL稀釋后樣品溶液加入3.8 mL ABTS反應液中,室溫下孵育6 min后用722型分光光度計在734 nm波長下測定吸光度(B),空白調零液為雙蒸水,吸光度抑制率X=(A-B)/A與樣品溶液濃度成正比。應用0～1000 μmol/L Trolox溶液作為參考標準繪制標準曲線,TEAC值換算成μmol Trolox/g DW樣品。計算公式為:

TEAC=10-3×100×N×C×V/M(100-Q)(μmol Trolox/g DW)

式中:N為樣品溶液的稀釋倍數,C為樣品溶液吸光度抑制率對應的Trolox濃度(μmol/L),V為樣品溶液總體積(mL),M為稱取樣品的質量(g),Q為樣品水分含量(%)。

1.2.8 總酚含量(TPC)測定 參照Singleton等[15]的方法進行總酚含量測定,略有改動。樣品溶液用雙蒸水適當稀釋,使最終吸光度落在標準曲線的線性范圍。取0.5 mL稀釋后樣品溶液加入2.5 mL福林酚試劑(0.2 mol/L)中,反應4 min后,加入2 mL飽和碳酸鈉溶液(約75 g/L),室溫下孵育2 h后用722型分光光度計在760 nm波長下測定吸光度,空白調零液為0.5 mL雙蒸水加2.5 mL福林酚溶液、2 mL飽和碳酸鈉溶液(孵育2 h)。應用0～200 mg/L沒食子酸溶液作為參考標準繪制標準曲線,TPC值換算成mg沒食子酸當量(gllic acid equivalent,GAE)/g DW樣品。計算公式為:

TPC=10-3×100×N×C×V/M(100-Q)(mg GAE/g DW)

式中:N為樣品溶液的稀釋倍數,C為樣品溶液吸光度對應的沒食子酸濃度(mg/L),V為樣品溶液總體積(mL),M為稱取樣品的質量(g),Q為樣品水分含量(%)。

1.3 數據處理與分析

除含水量測定外,每組實驗均重復3次,結果表示為平均值±標準差。應用Excel 2007和SPSS 22進行數據處理與分析。

2 結果與分析

2.1 11種葡萄的水分含量

11種葡萄皮、肉、籽的含水量如圖1所示。11種葡萄的皮、肉、籽含水量差別較大,其中葡萄肉含水量最高,范圍是72.35%～85.12%;葡萄皮含水量居中,范圍是58.70%～79.02%;11種葡萄中只有巨峰、紅提和珍珠黑提三種葡萄有籽,其含水量較低,分別為41.66%、46.42%和46.65%。為避免鮮重中水分對FRAP、TEAC和TPC的影響,后續(xù)實驗以上三個指標將采用干重值表示。

圖1 11種葡萄皮、肉、籽的水分含量(%)Fig.1 Moisture contents(%)of peels,pulps and seeds from 11 grape varieties

2.2 11種葡萄的鐵還原能力

如圖2所示,11種葡萄皮總FRAP范圍是(112.86±5.98)～(658.93±28.63) μmol Fe(Ⅱ)/g DW;珍珠黑提、巨峰葡萄、無籽黑提、玫瑰香黑提和夏黑葡萄這5種葡萄皮總FRAP最高,分別是(658.93±28.63)、(483.53±32.20)、(434.47±19.10)、(420.42±29.75)和(339.03±28.00) μmol Fe(Ⅱ)/g DW。11種葡萄肉總FRAP范圍是(6.89±0.39)～(79.04±3.10) μmol Fe(Ⅱ)/g DW;珍珠黑提、珍珠青提、無籽露葡萄、火焰葡萄和無籽青提這5種葡萄肉總FRAP最高,分別是(79.04±3.10)、(36.89±0.78)、(31.99±0.71)、(25.91±1.15)和(25.09±1.05) μmol Fe(Ⅱ)/g DW。而對于3種葡萄籽,珍珠黑提籽、紅提籽和巨峰葡萄籽總FRAP分別為(1608.34±66.55)、(1049.00±36.28)和(723.61±29.20) μmol Fe(Ⅱ)/g DW。此外,脂溶性部分FRAP通常比水溶性部分FRAP大,結合態(tài)部分FRAP通常較小,占總FRAP的比例很小。

圖2 11種葡萄皮(A)、肉(B)、籽(C)的鐵還原能力Fig.2 FRAP values of peels(A),pulps(B),seeds(C)from 11 grape varieties

本次研究的11種葡萄,葡萄籽總FRAP遠大于葡萄皮,而葡萄皮總FRAP也明顯大于葡萄肉。

此外,將本研究結果與測定其他天然產物的研究結果相比較(如表1所示),發(fā)現葡萄籽總FRAP遠比大多數蔬菜、水果、水果皮及種子、野果、野花、蘑菇、中草藥的高;其葡萄皮總FRAP比大多數蔬菜、水果、水果皮及種子、蘑菇的高,也比某些野果、野花、中草藥的高;其葡萄肉總FRAP則較小,但仍比某些蔬菜、水果、蘑菇的高[17-23]。

表1 天然產物的抗氧化活性和總酚含量比較Table 1 Comparison of antioxidant activities and total phenolic contents of natural products

2.3 11種葡萄的ABTS自由基清除能力

如圖3所示,11種葡萄皮總TEAC范圍是(37.56±1.17)～(374.52±15.90) μmol Trolox/g DW;珍珠黑提、巨峰葡萄、玫瑰香黑提、無籽黑提和夏黑葡萄這5種葡萄皮總TEAC最高,分別是(374.52±15.90)、(227.96±6.04)、(210.33±12.89)、(201.45±6.11)和(197.57±13.72) μmol Trolox/g DW。11種葡萄肉總TEAC范圍是(3.02±1.02)～(32.50±1.75) μmol Trolox/g DW;珍珠黑提、珍珠青提、無籽青提、玫瑰香黑提和無籽露葡萄這5種葡萄肉總TEAC最高,分別是(32.50±1.75)、(13.13±0.57)、(12.96±0.35)、(10.32±0.52)和(10.24±0.18) μmol Trolox/g DW。而對于3種葡萄籽,珍珠黑提籽、紅提籽和巨峰葡萄籽總TEAC分別為(887.38±36.18)、(548.58±16.43)和(440.00±19.61) μmol Trolox/g DW。此外,脂溶性部分TEAC通常比水溶性部分TEAC大,結合態(tài)部分TEAC通常較小,占總TEAC的比例很小。

圖3 11種葡萄皮(A)、肉(B)、籽(C)的自由基清除能力Fig.3 TEAC values of peels(A),pulps(B),seeds(C)from 11 grape varieties

本次研究的11種葡萄,葡萄籽總TEAC遠大于葡萄皮的,而葡萄皮總TEAC也明顯大于葡萄肉的。此外,由表1可知,葡萄籽總FRAP遠比大多數蔬菜、水果、水果皮及種子、野果、野花、蘑菇、中草藥的高;其葡萄皮總FRAP比大多數蔬菜、水果、水果皮及種子、蘑菇的高,也比某些野果、野花、中草藥的高;其葡萄肉總FRAP則較小,但仍比某些蔬菜、水果、蘑菇的高[17-23]。

2.4 11種葡萄的總酚含量

如圖4所示,11種葡萄皮總TPC范圍是(12.09±0.40)～(73.12±4.28) mg GAE/g DW;珍珠黑提、巨峰葡萄、無籽黑提、玫瑰香黑提和夏黑葡萄皮總TPC最高,分別是(73.12±4.28)、(72.89±4.73)、(43.16±1.75)、(41.63±2.57)和(34.97±1.30) mg GAE/g DW。11種葡萄肉總TPC范圍是(1.51±0.13)～(9.37±0.35) mg GAE/g DW;珍珠黑提、無籽青提、珍珠青提、無籽露葡萄和無籽黑提這5種葡萄肉總TPC最高,分別是(9.37±0.35)、(5.24±0.17)、(4.65±0.08)、(4.26±0.07)和(4.14±0.09) mg GAE/g DW。而對于3種葡萄籽,珍珠黑提籽、紅提籽、巨峰葡萄籽總TPC分別為(133.53±1.43)、(95.78±2.95)和(74.01±1.46) mg GAE/g DW。此外,脂溶性部分TPC通常比水溶性部分TPC大,結合態(tài)部分TPC通常較小,占總TPC的比例很小。

圖4 11種葡萄皮(A)、肉(B)、籽(C)的總酚含量Fig.4 TPC values of peels(A),pulps(B),seeds(C)from 11 grape varieties

本次研究的11種葡萄,葡萄籽總TPC遠大于葡萄皮的,而葡萄皮總TPC明顯大于葡萄肉的。此外,由表1可知,葡萄籽總TPC遠比大多數蔬菜、水果、水果皮及種子、野果、野花、蘑菇、中草藥的高;其葡萄皮總TPC比大多數蔬菜、水果、水果皮及種子、蘑菇的高,也比某些野果、野花、中草藥的高;其葡萄肉總TPC則較小,但仍比某些蔬菜、水果、蘑菇的高[17-23]。

2.5 FRAP、TEAC和TPC之間的關系

采用簡單線性回歸模型分析FRAP、TEAC和TPC之間的關系,評價11種葡萄皮、肉、籽抗氧化活性的特點及主要活性成分,結果如圖5～圖7所示。對于11種葡萄皮、肉、籽,總FRAP值與總TPC值都具有較好的線性關系(R2分別為0.898、0.843、1.000,p<0.05),表明酚類物質具有還原能力,可以還原Fe(Ⅲ)等氧化劑。相似地,總TEAC值與總TPC值具有較好的線性關系(R2分別為0.840、0.881、0.982,p<0.05),表明酚類物質具有Trolox等效抗氧化能力,可以清除ABTS等自由基。此外,總FRAP值和總TEAC值同樣具有較好的線性相關系(R2分別為0.967、0.906、0.981,p<0.05),表明其活性成分同時具有還原能力和自由基清除能力,印證了前述兩項結果。以上結果與針對56種蔬菜、56種野果、51種花、50種水果的廢棄物(皮和種子)、49種蘑菇的研究結果相似[18-22],原因可能在于酚類是這些天然產物的主要抗氧化活性成分之一;與針對62種水果和223種中草藥的研究結果略有不同[17,23],原因可能在于這些水果和中草藥的主要抗氧化活性成分不是酚類,而是皂苷類、單萜類等。綜上所述,酚類物質是11種葡萄主要抗氧化活性成分,同時具有還原能力和自由基清除能力。

圖5 11種葡萄皮(A)、肉(B)、籽(C)總FRAP值和總TPC值的關系Fig.5 Correlations between total FRAP values and total TPC values of peels(A),pulps(B),seeds(C)from 11 grape varieties

圖6 11種葡萄皮(A)、肉(B)、籽(C)總TEAC值和總TPC值的關系Fig.6 Correlations between total TEAC values and total TPC values of peels(A),pulps(B),seeds(C)from 11 grape varieties

圖7 11種葡萄皮(A)、肉(B)、籽(C) 總FRAP值和總TEAC值的關系Fig.7 Correlations between total FRAP values and total TEAC values of peels(A),pulps(B),seeds(C)from 11 grape varieties

2.6 聚類分析

根據FRAP、TEAC和TPC的結果,采用系統(tǒng)聚類分析,將11種葡萄皮和肉進行歸類和描述,其系統(tǒng)樹狀圖如圖8所示。結合描述性分析結果,可以將11種葡萄皮和肉按照抗氧化活性強弱及總酚含量高低分成3類。對于葡萄皮,第一類包含1種葡萄,即珍珠黑提,此類FRAP、TEAC和TPC最高,分別為658.93 μmol Fe(Ⅱ)/g DW、374.52 μmol Trolox/g DW和73.12 mg GAE/g DW;第二類包含4種葡萄,即巨峰、夏黑、無籽黑提和玫瑰香黑提,均為黑皮葡萄,此類FRAP、TEAC和TPC(均值)居中,分別為419.36 μmol Fe(Ⅱ)/g DW、209.33 μmol Trolox/g DW和48.16 mg GAE/g DW;第三類包含6種葡萄,即紅提、無籽紅提、火焰葡萄、珍珠青提、無籽青提和無籽露葡萄,為3種紅皮葡萄和3種綠皮葡萄,此類FRAP、TEAC和TPC(均值)較小,分別為169.55 μmol Fe(Ⅱ)/g DW、77.14 μmol Trolox/g DW和19.34 mg GAE/g DW。對于葡萄肉,第一類包含1種葡萄,即珍珠黑提,此類FRAP、TEAC和TPC最高,分別為79.04 μmol Fe(Ⅱ)/g DW、32.50 μmol Trolox/g DW和9.37 mg GAE/g DW;第二類包含3種葡萄,即珍珠青提、無籽青提和無籽露葡萄,均為綠皮葡萄,此類FRAP、TEAC和TPC(均值)居中,分別為31.32 μmol Fe(Ⅱ)/g DW、12.11 μmol Trolox/g DW和4.72 mg GAE/g DW;第三類包含7種葡萄,即巨峰、夏黑、無籽黑提、玫瑰香黑提、紅提、無籽紅提和火焰葡萄,為4種黑皮葡萄和3種紅皮葡萄,此類FRAP、TEAC和TPC(均值)較小,分別為14.99 μmol Fe(Ⅱ)/g DW、7.13 μmol Trolox/g DW和3.24 mg GAE/g DW。由此可以看出,珍珠黑提皮和肉的抗氧化活性和總酚含量都是最高的,黑皮葡萄的皮比紅皮葡萄和綠皮葡萄的皮具有更高的抗氧化活性和總酚含量,而綠皮葡萄的肉比黑皮葡萄和紅皮葡萄的肉具有更高的抗氧化活性和總酚含量。

圖8 11種葡萄皮(A)和肉(B)系統(tǒng)聚類樹狀圖Fig.8 Systematic clustering dendrogram of peels(A),pulps(B)from 11 grape varieties

由以上分析結果可知,酚類物質是使得葡萄具有抗氧化功能的主要活性成分,不同葡萄品種、不同葡萄部位具有不同的抗氧化活性和總酚含量。對于葡萄肉而言,珍珠黑提、珍珠青提、無籽青提、無籽露葡萄和玫瑰香黑提具有較高的抗氧化活性和總酚含量,因此果農可以更多地種植這些葡萄品種,人們可以選擇食用這些品種的葡萄以獲得更高的營養(yǎng)價值。葡萄皮和籽通常比葡萄肉具有更高的抗氧化活性和總酚含量,因此具有更高的營養(yǎng)價值。人們食用葡萄時可以考慮清洗干凈后帶皮攝入,以獲得更多的營養(yǎng)物質。而由于紅葡萄酒是用葡萄肉和皮一起壓榨、發(fā)酵的,白葡萄酒是用去皮的葡萄肉壓榨、發(fā)酵的,所以紅葡萄酒通常比白葡萄酒營養(yǎng)價值更高,期望通過適量飲用葡萄酒獲得某些保健功效的消費者可以選擇紅葡萄酒。此外,葡萄中的酚類物質除具有抗氧化功能外,還具有抗菌、抗炎、抗癌、保護肝臟和保護心血管等多種生物學功能,將葡萄酒和葡萄汁工業(yè)中的副產物(葡萄皮和籽),用于開發(fā)生產功能食品,具有重要的經濟價值。

3 結論

本研究系統(tǒng)評價了11種葡萄各部位(皮、肉、籽)的鐵還原能力、自由基清除能力和總酚含量。研究發(fā)現,對于不同葡萄品種,珍珠黑提、巨峰葡萄、無籽黑提、玫瑰香黑提和紅提的皮,珍珠黑提、珍珠青提、無籽青提、無籽露葡萄和玫瑰香黑提的肉,具有較高的鐵還原能力、自由基清除能力和總酚含量,而三種葡萄籽這三個指標大小順序為珍珠黑提>紅提>巨峰;對于不同葡萄部位,通常這三個指標大小順序為籽>皮>肉;對于不同溶解性部分,通常這三個指標大小順序為脂溶性部分>水溶性部分>結合態(tài)部分。此外,FRAP、TEAC、TPC兩兩之間均具有較好的相關關系,表明酚類物質是使得葡萄具有抗氧化功能的主要活性成分,且同時具有還原能力和自由基清除能力。