王亞峰，王愛霞，王生彪，朵德龍，李 茜，嚴(yán)英俊

(青海省人民醫(yī)院靜配中心，西寧 810007)

HAPH主要是因高原習(xí)服不適應(yīng)或不良適應(yīng)而引起的以肺血管收縮、肺血管重構(gòu)以及肺血管平滑肌細(xì)胞過度增殖等病理改變?yōu)樘卣鞯募膊?，其中肺?dòng)脈平滑肌細(xì)胞過度增殖和肺血管重構(gòu)被認(rèn)為是HAPH最主要的病理機(jī)制[1]。此外，研究表明，RhoA/ROCK信號(hào)通路過度激活在人類肺動(dòng)脈高壓發(fā)病過程中起到重要作用，故抑制這一信號(hào)通路亦是治療肺動(dòng)脈高壓的重要靶標(biāo)之一[2]。甘西鼠尾草又名大紫丹參、甘肅丹參，為唇形科鼠尾草屬植物，主產(chǎn)于甘肅、四川、云南、西藏和青海等地，是著名的藏藥之一(藏藥名：吉恩子保)[3]，其作為青藏高原丹參的代用品，是目前治療心血管疾病和高原病的常用中藏藥材[4]。本實(shí)驗(yàn)通過采用實(shí)地高原環(huán)境構(gòu)建HAPH大鼠模型，旨在探究SPM預(yù)防HAPH的作用，并通過研究其在抑制平滑肌細(xì)胞增殖和RhoA/ROCK信號(hào)通路方面的作用探究其可能的分子機(jī)制，現(xiàn)將有關(guān)結(jié)果匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠70只，體重120～160 g，SPF級(jí)，均購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(陜)2017-003。

1.2 藥品和試劑

SPM藥液(自制)：為SPM藥材采用70%的乙醇溶液超聲提取、過濾、干燥后所得的浸膏粉用蒸餾水配置所得；氨基甲酸乙酯(烏來糖)：購自上海展云化工有限公司；肝素鈉注射液：購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團(tuán)有限責(zé)任公司；RNA提取試劑盒(批號(hào)：AA6901-1)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：AI40713A)和RT-PCR反應(yīng)試劑盒(批號(hào)：AA1102-1)以及引物(批號(hào)：CIPG886)均購自TaKaRa公司。

1.3 儀器和設(shè)備

MP150十六導(dǎo)生理信號(hào)采集系統(tǒng)(BioPac，美國)、高速低溫臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf，德國)、NanoDrop核酸濃度測(cè)量?jī)x(Thermo，美國)、實(shí)時(shí)定量PCR儀(Applied Biosystems，美國)。

1.4 動(dòng)物分組與給藥

將70只SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、缺氧組、SPM(0.5 g/kg、1 g/kg、2 g/kg)劑量組，每組14只，對(duì)照組飼養(yǎng)于西寧(海拔約2 260 m)，其余組均飼養(yǎng)于瑪多縣人民醫(yī)院(海拔約4 260 m)。SPM劑量組灌胃不同濃度的SPM(1 ml/100 g)，濃度分別為0.5 g/kg、1 g/kg、2 g/kg(1 g/kg劑量為SPM生藥臨床常用劑量的等效劑量)，對(duì)照組和缺氧組灌胃等體積蒸餾水，每日一次，連續(xù)處理4 周。

1.5 大鼠平均動(dòng)脈壓mPAP測(cè)定

4周后每組大鼠經(jīng)腹腔注射20%的烏拉坦(100 mg/kg)麻醉后仰位固定于手術(shù)臺(tái)上，分離右側(cè)頸靜脈，然后將與壓力傳感器相連的聚乙烯導(dǎo)管迅速插入血管，根據(jù)MP150十六導(dǎo)生理信號(hào)采集系統(tǒng)采集到的血壓波形曲線調(diào)整導(dǎo)管的位置，導(dǎo)管經(jīng)上腔靜脈、右心房、右心室、最終到達(dá)肺動(dòng)脈，從而測(cè)得各組大鼠的mPAP[5]。

1.6 大鼠肺組織中PCNA、CDK4、CyclinD1、RhoA、ROCK1、ROCK2的mRNA表達(dá)水平測(cè)定

大鼠經(jīng)放血處死后，迅速取右肺下葉組織約1 g，剪碎，用錫箔紙包裹后裝于無酶管中，置液氮中保存?zhèn)溆?約2 min左右完成)。取凍存的肺組織樣品，用RNA提取試劑盒分別提取總RNA后，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟依次進(jìn)行后續(xù)的RT反應(yīng)。以2 μl得到的cDNA產(chǎn)物為模板，以GAPDH為內(nèi)參，在PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增相應(yīng)基因片段，每個(gè)樣品進(jìn)行3次RT-PCR實(shí)驗(yàn)，具體采用兩步法PCR反應(yīng)程序，第一步反應(yīng)條件為95℃，120 s，1個(gè)循環(huán)，第二步反應(yīng)條件為95℃，30 s，60℃，60 s，40個(gè)循環(huán)，95℃，10 s，60℃，60 s。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)RT-PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，確認(rèn)得出數(shù)據(jù)的可信性，并以GAPDH做歸一化處理后，通過F=2-△△ct計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。具體引物序列詳見表1。

Tab. 1 Primer sequences

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SPM對(duì)大鼠mPAP的影響

由表2可知，與對(duì)照組比較，缺氧組大鼠的mPAP明顯升高(P<0.01)，提示HAPH造模成功。與缺氧組比較，SPM各劑量組大鼠的mPAP均降低，且1 g/kg和2 g/kg劑量組的mPAP與缺氧組比較(P均<0.01)。

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vshypoxia group

2.2 SPM對(duì)肺組織中PCNA、CDK4及CyclinD1 mRNA表達(dá)的影響

由表3可知，與對(duì)照組比較，缺氧組大鼠肺組織中PCNA、CDK4及CyclinD1 mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.01)；與缺氧組比較，SPM各劑量組大鼠肺組織中PCNA、CDK4及CyclinD1 mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)。

GroupPCNACDK4CyclinD1Control1.00±0.071.00±0.051.00±0.08Hypoxia2.31±0.25??1.75±0.14??3.43±0.34??0.5 g/kg SPM1.93±0.15##1.45±0.13##1.70±0.12##1 g/kg SPM1.42±0.06##1.30±0.04##1.48±0.06##2 g/kg SPM1.31±0.10##1.17±0.02##1.24±0.16##

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vshypoxia group

2.3 SPM對(duì)肺組織中RhoA、ROCK1及ROCK2 mRNA表達(dá)的影響

由表4可知，與對(duì)照組比較，缺氧組大鼠肺組織中RhoA、ROCK1及ROCK2 mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.01)；與缺氧組比較，SPM各劑量組大鼠肺組織中RhoA、ROCK1及ROCK2 mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

GroupRhoAROCK1ROCK2Control1.00±0.151.00±0.061.00±0.08Hypoxia9.06±1.37??3.88±0.25??2.84±0.22??0.5 g/kg SPM6.79±1.39#2.85±0.07##2.34±0.51#1 g/kg SPM5.26±0.66##2.58±0.06##2.12±1.20##2 g/kg SPM1.23±0.20##1.68±0.07##1.40±0.09##

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vshypoxia group

3 討論

HAPH是一種常見的慢性高原病，是因長(zhǎng)期暴露于高海拔環(huán)境而引起的以肺動(dòng)脈壓持續(xù)升高和肺血管重構(gòu)為特征的疾病，若不及時(shí)治療，可發(fā)展為嚴(yán)重的心臟病、心衰甚至死亡[6-7]。當(dāng)前對(duì)于該疾病的治療手段主要以干預(yù)血管收縮因子為主，如吸氧、NO吸入治療、使用鈣通道阻滯劑和磷酸二酯酶抑制劑等，這些治療措施的特點(diǎn)是僅能緩解癥狀，很難逆轉(zhuǎn)疾病的惡化[8]，加之HAPH的預(yù)后不佳，不僅增加患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[9]，故研究新型治療藥物刻不容緩。本研究發(fā)現(xiàn)測(cè)試劑量的SPM均可降低HAPH大鼠的mPAP，其中1 g/kg和2 g/kg給藥組大鼠的mPAP降低作用更顯著，且與模型組比較均具有顯著性差異。但是就兩個(gè)劑量的mPAP而言，并無顯著性差異，提示給予臨床常用劑量的等效劑量即1 g/kg的SPM，即可發(fā)揮明顯的預(yù)防HAPH的作用。

HAPH是一種進(jìn)行性的疾病，具體病因機(jī)制目前尚不明確，其病理改變主要涉及肺血管收縮反應(yīng)、持續(xù)的肺動(dòng)脈壓升高、肺血管重構(gòu)等方面[10]。研究表明[11]，高原低氧可刺激肺血管收縮和肺血管抵抗增加，導(dǎo)致肺血管重構(gòu)和平滑肌細(xì)胞增殖增加，而肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的過度增殖和肺血管重構(gòu)是HAPH最重要的病理機(jī)制[12]。故抑制肺動(dòng)脈平滑肌過度增殖和逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)是預(yù)防和治療HAPH的重要靶標(biāo)。PCNA是細(xì)胞增殖的分子標(biāo)志物之一，是一種核蛋白和DNA聚合酶的輔因子，靜息期細(xì)胞很少表達(dá)PCNA，其主要在細(xì)胞周期的S期被檢測(cè)到[13-14]；同時(shí)CDK4和CyclinD1是細(xì)胞增殖過程中G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵調(diào)控因子，而且其可激活細(xì)胞周期進(jìn)程中重要的轉(zhuǎn)錄因子[15]。本研究發(fā)現(xiàn)SPM可明顯降低大鼠肺組織中PCNA、CDK4以及CyclinD1的mRNA表達(dá)水平，從而抑制細(xì)胞的增殖過程，提示SPM可能具有抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞過度增殖的作用。

盡管目前啟動(dòng)肺血管重構(gòu)的分子和細(xì)胞機(jī)制尚不清楚，但前期研究已經(jīng)表明，RhoA/ROCK信號(hào)通路可直接影響細(xì)胞的增殖、凋亡、收縮和運(yùn)動(dòng)，從而在人類肺動(dòng)脈高壓的病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[16-17]，而且已有研究表明，ROCK特異性抑制劑可通過抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞過度增殖、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和炎細(xì)胞浸潤(rùn)而抑制肺動(dòng)脈重構(gòu)、改善肺動(dòng)脈血流分布，從而降低肺動(dòng)脈壓[18-20]。RhoA是一種小型單體G蛋白，屬于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和生存的Ras超家族蛋白；ROCK則為分子量約160 kDa的絲氨酸/蘇安酸激酶，其有兩種亞型，分別是ROCK1和ROCK2，且上述因子均可在血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)[19]。本研究結(jié)果顯示，SPM可明顯降低RhoA、ROCK1和ROCK2在肺組織中的mRNA表達(dá)水平，提示SPM可能對(duì)RhoA/ROCK信號(hào)通路過度激活具有一定的抑制作用。

綜上所述，甘西鼠尾草對(duì)大鼠HAPH具有一定的預(yù)防作用，其機(jī)制可能與抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞過度增殖和RhoA/ROCK信號(hào)通路過度激活有關(guān)。對(duì)其發(fā)揮作用的具體成分和深入的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究確定。

致謝：感謝青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心在本研究中所給予的大力支持和幫助！