顏新建，李高峰△，唐 梅，楊小平

(1. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬株洲醫(yī)院腫瘤科，湖南 株洲 412000；2. 湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院 小分子靶向藥物研究與創(chuàng)制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410013)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在男性惡性腫瘤中發(fā)病率高居第4，早期膀胱癌預(yù)后一般較好，但發(fā)展到中晚期整體預(yù)后較差，治療成本高，防治形勢(shì)不容樂(lè)觀[1]。因此深入探討膀胱癌的發(fā)病機(jī)理及尋求新的治療方法尤為重要。脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FASN)是催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A合成棕櫚酸酯的關(guān)鍵酶，為機(jī)體儲(chǔ)存能量，參與細(xì)胞脂質(zhì)代謝。FASN在正常人體組織中除脂肪組織、肝組織、新生兒肺臟外表達(dá)很低，而研究報(bào)道多種腫瘤如乳腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌等存在FASN高表達(dá)，可見(jiàn)FASN與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，F(xiàn)ASN可能是潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)[2-5]。目前其在膀胱癌中的報(bào)道少見(jiàn)，因此本實(shí)驗(yàn)組就FASN在膀胱癌及正常膀胱組織中的表達(dá)，利用siRNA技術(shù)抑制FASN表達(dá)后對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與分組

從中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬株洲醫(yī)院病理科收集45例石蠟塊，包括30例膀胱癌電切術(shù)后獲得的膀胱癌組織及15例膀胱造瘺術(shù)后活檢獲得的正常膀胱組織，用作對(duì)照，蠟塊連續(xù)切片用于后續(xù)免疫組化，組織病理結(jié)果經(jīng)我院2位病理科醫(yī)生證實(shí)；以上組織均得到被取材人口頭同意，并征得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及經(jīng)患者同意；人膀胱癌細(xì)胞系UMUC3由郭鵬教授饋贈(zèng)；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒、羊抗兔二抗購(gòu)自天根生化科技公司；脂質(zhì)體2000購(gòu)自美國(guó)QIAGEN公司；FASN siRNA及無(wú)義siRNA由擎科生物科技有限公司合成；兔抗人FASN抗體為美國(guó)CST公司產(chǎn)品。胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清、牛血清蛋白購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，標(biāo)準(zhǔn)蛋白mark為T(mén)hermo公司產(chǎn)品。

1.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)膀胱癌組織中FASN蛋白表達(dá)

采用免疫組化PV-6000法依次對(duì)組織切片行脫蠟、水化，枸櫞酸鹽修復(fù)液修復(fù)抗原、血清封閉，一組滴加FASN抗體(1∶1 000)，另一組滴加PBS作為對(duì)照，4℃孵育過(guò)夜，PBS清洗3次，加二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗)室溫孵育1 h,DAB液顯色，蘇木素行核復(fù)染，水洗并觀察染色程度，分化、脫水、封片后顯微鏡下觀察。FASN蛋白表達(dá)陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色分布，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例來(lái)確定FASN蛋白表達(dá)強(qiáng)弱：(1)無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞(-)；<25%細(xì)胞呈陽(yáng)性(+)；>25%細(xì)胞呈陽(yáng)性(++)；>50%細(xì)胞為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.3 UMUC3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人膀胱癌UMUC3細(xì)胞株用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)，取生長(zhǎng)狀態(tài)好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將200 μl細(xì)胞懸液包含8×104cells接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，利用脂質(zhì)體2000將FASN siRNA及無(wú)義siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，依據(jù)轉(zhuǎn)染siRNA不同分siFASN組(轉(zhuǎn)染FASN siRNA)及siControl組(轉(zhuǎn)染無(wú)義siRNA)，繼續(xù)培養(yǎng)，免疫熒光法鑒定轉(zhuǎn)染效果。

1.4 MTT法檢測(cè)UMUC3細(xì)胞的增殖活力

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，混勻接種于96孔板，使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，換DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)轉(zhuǎn)染FASN siRNA和無(wú)義siRNA，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后除去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加入50 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)5 h，隨后吸去培養(yǎng)基加150 μl二甲基亞砜，避光振蕩10 min,每組細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處檢出每孔OD值,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)UMUC3細(xì)胞的遷移能力

接種5×105cells于6孔板，按照脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞貼壁后，用10 μl槍頭劃痕，劃線過(guò)程中使槍頭保持垂直，PBS清洗1遍，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于劃后0 h、24 h、48 h拍照，每組細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。劃痕遷移能力=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)UMUC3細(xì)胞的侵襲能力

收集胰酶消化懸浮的細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基重懸為單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105cells/ml。使用10 μm孔徑的Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲力檢測(cè)，將200 μl細(xì)胞懸液包含3×104個(gè)細(xì)胞加入24孔板Transwell小室中。在24孔板下室加入600 μl完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后用濕棉簽擦去小室內(nèi)的細(xì)胞，小室底膜用結(jié)晶紫染色，PBS清洗小室，徹底晾干后顯微鏡下拍照。每片隨機(jī)選取5個(gè)100×視野計(jì)數(shù)，取平均數(shù)進(jìn)行分析。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)UMUC3細(xì)胞FASN mRNA表達(dá)

根據(jù)Trizol說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,FASN引物序列(由擎科生物科技有限公司合成)為：上游引物：5＇-TGCCCTGAGCTGGACTACTT-3＇，下游引物：5＇-AAAGCTGCTCAGGACCATGT-3＇；RT-PCR反應(yīng)條件：95℃ 150 s，95℃ 30 s、55℃ 20 s、72℃ 30 s共循環(huán)35次。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算FASN mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 蛋白印跡法(Western blot)檢測(cè)UMUC3細(xì)胞FASN蛋白表達(dá)

按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取總蛋白，BCA法測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度。每樣本100 μg進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉TBST液封閉1 h，一抗雜交(FASN,1∶1 000；β-actin,1∶ 5 000)，4℃孵育過(guò)夜，清洗，二抗(羊抗兔1∶ 5 000；羊抗鼠 1∶5 000)37℃孵育1 h,暗室中顯影，Image J軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 FASN蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示FASN蛋白在膀胱癌組織中過(guò)表達(dá)，表現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色分布(圖1，見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅲ)，30例膀胱癌組織中有18例FASN蛋白表達(dá)陽(yáng)性，而15例正常膀胱組織中均無(wú)FASN蛋白陽(yáng)性表達(dá)，膀胱癌組織中FASN蛋白陽(yáng)性率(60.0%)顯著高于正常膀胱組織(0.0%，P=0.000),且膀胱癌組織中FASN蛋白表達(dá)與病理分期及分級(jí)密切相關(guān)，F(xiàn)ASN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率隨病理分期、分級(jí)的增高而增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05, 表1)。

Tab. 1 Expression levels of FASN protein in bladder cancer and normal bladder tissues (n=45)

GroupnFASN(+)FASN(-)χ2PNormal bladder tissue1501515.0000.000??Bladder carcinoma tissue301812 Pathological stageTa-T1T2-T42371171206.0870.014# Pathological gradeG1G2G3141245949307.2320.027△

**P<0.01vsnormal bladder tissue group;#P<0.05vsTa-T1 group;△P<0.05vsG1 group

2.2 FASN轉(zhuǎn)染效果鑒定及對(duì) FASN表達(dá)影響

篩選、鑒定轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞株，觀察 siFASN組和siControl組細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白在兩組細(xì)胞胞質(zhì)中均有不同程度的表達(dá)，同等大小視野下siFASN組熒光蛋白表達(dá)量明顯少于siControl組(P<0.05，圖2，見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅲ)；RT-PCR結(jié)果示siFASN組、siControl組FASN mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.17±0.11，0.42±0.13；siFASN組細(xì)胞FASN mRNA水平明顯低于siControl組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05，表2)，Western blot結(jié)果示siFASN組、siControl組FASN蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為：0.96±0.11，0.18±0.08，siFASN組細(xì)胞幾乎無(wú)FASN蛋白表達(dá)(圖3)，轉(zhuǎn)染效果好，與siControl組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig. 3 FASN expression changes after transfection of FASN siRNA in UMUC3 cells (n=3)

2.3 下調(diào)FASN表達(dá)對(duì)UMUC3細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示siFASN組細(xì)胞在48 h、72 h時(shí)的增殖抑制率分別為：38.12%±1.44%、58.33%±3.52%，siControl組細(xì)胞在48 h、72 h時(shí)的增殖抑制率分別為：21.97%±1.39%、30.83%±1.92%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)；膀胱癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染FASN siRNA后生長(zhǎng)抑制明顯，且具有時(shí)間依賴(lài)性。

2.4 下調(diào)FASN表達(dá)對(duì)UMUC3細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在24 h、48 h siFASN組細(xì)胞遷移距離較siControl組短(圖4)，siFASN組、siControl組細(xì)胞平均遷移能力分別為：20.44±1.47、 79.04±2.11，siFASN組細(xì)胞的遷移能力較siControl組明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

Tab. 2 The FASN mRNA, proliferation and migration ability changes after transfecting FASN siRNA into UMUC3 cell lines n=3)

*P<0.05vsthe siControl group

2.5 下調(diào)FASN表達(dá)對(duì)UMUC3細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell試驗(yàn)結(jié)果顯示siFASN組、siControl組平均過(guò)膜細(xì)胞數(shù)分別為66.70±2.01、175.10±2.14,siFASN組平均過(guò)膜細(xì)胞數(shù)較siControl組明顯減少，即siFASN組細(xì)胞的侵襲能力較siControl組明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

Fig. 4 Cell migration ability changes after transfection of FASN siRNA in UMUC3bladder cancer cells (Inverted microscope × 40)

*Pvsthe siControl group

3 討論

膀胱癌是我國(guó)男性發(fā)病率第6位的流行性惡性腫瘤[6]，早期階段預(yù)后一般較好，但發(fā)展到中晚期常規(guī)治療療效欠佳，靶向治療有望成為新的突破口。目前已有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的生物代謝方式與正常細(xì)胞不同，特別是糖代謝和脂質(zhì)代謝，研究證實(shí)腫瘤細(xì)胞自身合成的脂肪酸占其所有脂肪酸的90%以上，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)WarBurg效應(yīng)在產(chǎn)能的同時(shí)生成大量的乙酰輔酶A(CoA)[7]，乙酰輔酶A及丙二酰輔酶A是脂肪酸合成酶(fatty acid synthase FASN)的底物，F(xiàn)ASN催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A合成長(zhǎng)鏈脂肪酸，這些長(zhǎng)鏈脂肪酸隨后轉(zhuǎn)化為對(duì)于腫瘤細(xì)胞生物膜及脂質(zhì)合成、蛋白修飾定位、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等至關(guān)重要的代謝脂質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移提供優(yōu)越條件，發(fā)揮其惡性生物學(xué)行為[8,9]，F(xiàn)ASN對(duì)于腫瘤細(xì)胞異常代謝尤其是脂質(zhì)代謝至關(guān)重要，研究FASN對(duì)腫瘤的發(fā)病機(jī)制及干預(yù)其生物學(xué)行為等具有十分重大的意義。

目前，F(xiàn)ASN被報(bào)道在多個(gè)瘤種如胰腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌中過(guò)表達(dá)，F(xiàn)ASN在腫瘤組織中過(guò)表達(dá)而在絕大多數(shù)正常組織中低表達(dá)或無(wú)表達(dá)的特性使其有望成為新的腫瘤治療靶點(diǎn)。LIANG SUN等[10]用Western blot法發(fā)現(xiàn)胃癌組織中FASN蛋白高表達(dá)，隨后用siRNA技術(shù)發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)ASN可通過(guò)mTOR/GLIL信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移。JIAOJIAO GONG等[11]也有類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)，體外實(shí)驗(yàn)表明抑制FASN可以有效干擾腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等。本研究采用免疫組化法發(fā)現(xiàn)FASN在膀胱癌組織中過(guò)表達(dá)，且與病理分期及分級(jí)密切相關(guān)，F(xiàn)ASN陽(yáng)性表達(dá)率隨著病理分期和分級(jí)的增高而升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與鄧?yán)缀氲萚12]研究結(jié)果一致，這提示FASN表達(dá)可能是膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中一個(gè)重要的分子事件，F(xiàn)ASN陽(yáng)性表達(dá)率與膀胱癌的浸潤(rùn)深度、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，F(xiàn)ASN對(duì)鑒別膀胱癌惡性分型及分期可能有一定的作用，由于本研究組織數(shù)量偏少，這一結(jié)果還需大樣本研究佐證。

進(jìn)一步研究下調(diào)FASN表達(dá)對(duì)UMUC3膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，相比siControl組,我們發(fā)現(xiàn)siFASN組細(xì)胞FASN表達(dá)在蛋白質(zhì)水平和mRNA水平均明顯下降，siFASN組細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力均明顯下降(P<0.05)，抑制FASN表達(dá)使膀胱癌UMUC3細(xì)胞各項(xiàng)生物學(xué)功能均下調(diào)，與LIANG SUN、JIAOJIAO GONG等的研究結(jié)果一致，由于其較高的靶向性，這一結(jié)果提示抑制FASN表達(dá)可能高效的抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而無(wú)明顯的副作用。已有研究表明抑制FASN表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂，自身合成脂肪酸的能力下降，腫瘤細(xì)胞因脂肪酸供應(yīng)不足而出現(xiàn)脂質(zhì)饑餓，使其失去生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)條件，影響其各項(xiàng)生物學(xué)功能，最終表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移能力的廣泛抑制。FASN介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞特殊的脂質(zhì)代謝方式受多條信號(hào)通路調(diào)控，研究最多的是PI3K/AKT通路[13, 14]，PI3K/AKT信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、分化、代謝密切相關(guān)，細(xì)胞表型惡化與PI3K/AKT信號(hào)通路異常激活相關(guān)，F(xiàn)ASN基因被認(rèn)為是PI3K/AKT信號(hào)通路的一個(gè)下游基因。LIGONG CHANG等[13]研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)FASN表達(dá)可抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路活性，上游基因異常激活如腫瘤相關(guān)致病因素使FASN過(guò)表達(dá)，從而改變細(xì)胞脂質(zhì)代謝方式利于細(xì)胞惡變，并為其增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移行為等提供優(yōu)勢(shì)條件。抑制FASN可能通過(guò)抑制PI3K/AKT等相關(guān)通路活性影響細(xì)胞代謝和生物學(xué)行為從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。目前FASN抑制劑已廣泛用于抗腫瘤研究，頻繁報(bào)道出新型FASN抑制劑，如生物檳郎堿可顯著降低脂肪細(xì)胞內(nèi)FASN蛋白的表達(dá)[15]，影響其脂質(zhì)代謝；部分藥物如TVB-2640在抗腫瘤中的有效性及安全性在I期臨床試驗(yàn)中已有初步探討[16]，目前來(lái)看FASN抑制劑具有良好的應(yīng)用前景和發(fā)展空間,期待有大樣本的臨床研究。

總之，本研究首先在組織學(xué)水平上發(fā)現(xiàn)FASN在膀胱癌組織中過(guò)表達(dá)而在正常膀胱組織中無(wú)表達(dá)，進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)下調(diào)FASN表達(dá)能抑制膀胱癌UMUC3細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力，F(xiàn)ASN在膀胱癌中具有較高的靶向性，使FASN抑制劑有可能在高效殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)不產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，本文的研究結(jié)果可為FASN抑制劑的后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)，F(xiàn)ASN可能是膀胱癌潛在的治療靶點(diǎn)，抑制FASN表達(dá)有望成為一種新的膀胱癌治療方法。