崔桂玉，白 劍，苗蘭英，林大勇，王學良，劉喜成

(1. 內蒙古民族大學醫(yī)學院，通遼 028000；2. 遼寧中醫(yī)藥大學，沈陽 110847；3. 深圳市人民醫(yī)院麻醉科，廣東 深圳 518020)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一種與過量飲酒無關的，以肝臟脂類代謝異常，肝細胞內脂肪類物質蓄積過多而呈現(xiàn)彌漫性的肝脂肪變性為主要病理特征的一類臨床綜合征。隨著人民生活水平的逐步提高，居民飲食習慣發(fā)生了改變，在膳食中的脂肪比例逐漸增加，使得NAFLD的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年增加的態(tài)勢[1-2]。目前，NAFLD人群的數(shù)量在世界范圍內已經達到約100萬[3]，嚴重危害人類健康。NAFLD發(fā)病機制不明，涉及炎癥反應、脂質過氧化及免疫失衡等多種因素。近年來，越來越多的研究關注于免疫細胞及相關細胞因子在NAFLD中的作用，其中輔助性T細胞17 (T help cell 17, Th17)是研究的熱點，大量實驗研究也表明，Th17細胞與NAFLD的發(fā)生發(fā)展密切相關[4-5]。

中醫(yī)藥在NAFLD的治療中應該廣泛，中藥復方的功效以單味藥為基本單元，是在各種單味藥發(fā)揮療效的基礎上相互影響所獲得的。臨床應用中，單味藥能夠更好的控制藥品的有效成分，較少藥物副作用，而且便于制定規(guī)范的質量標準，臨床應用重復性較好。中藥丹參(Salvia mil)所具有的養(yǎng)血護肝、活血化瘀的功效，能夠有效改善肝臟微循環(huán)，清除氧自由基，抗肝纖維化，保護肝細胞[6]。既往研究表明，在NAFLD的中醫(yī)藥治療中，丹參具有明顯的降脂作用，臨床上最為常用[7]。然而丹參是否能夠通過免疫調節(jié)進而防治NAFLD及其具體機制尚不明確。本實驗通過高脂喂飼建立NAFLD大鼠模型，探討單味中藥丹參對非酒精性脂肪肝Th17細胞及相關細胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級別SD大鼠32只，全部為雄性，周齡為6，體重為170～200 g，由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。大鼠買入后先予標準飼料適應性喂養(yǎng)1周，4～5只放置于1個動物盒內，每日正常光照，燈光照射周期為12 h/12 h，空氣流通，自由飲水，飼養(yǎng)間室內溫度為(20±2)℃，濕度維持在50%～65%，更換墊料的頻率為隔天1次，以提供一個較為清潔的飼養(yǎng)環(huán)境，提高動物成活率。

1.2 實驗試劑和儀器

高脂飼料(飼料配方：基礎飼料、豬油30%、、酪蛋白25%、蔗糖8%、豆油3%、礦物質7%、纖維素7%、糊精20%)；甘油三酯(triglycerides, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL-C)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL-C)檢測試劑盒由四川邁克生物科技有限公司提供；丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase, AST)檢測試劑盒由北京中生北控生物科技股份有限公司提供；白細胞介素6(interleukin 6, IL-6)、白細胞介素17(interleukin 17, IL-17)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)酶聯(lián)免疫法(ELISA)試劑盒由美國Cloud-Clone公司提供；蘇木素-伊紅染液(HE)由南京建成科技有限公司提供；維甲酸相關孤兒核受體(retinoic acid-related orphan nuclear receptor, RORγt)熒光PCR試劑盒由日本Toyobo公司提供；實驗所需分析純由國藥集團提供。全自動生化檢測儀(型號：TBA-40FR)由日本東芝公司提供；流式細胞儀(型號：FACSAria)由美國BD公司提供；熒光倒置顯微鏡(型號：CKX53+DP80)由日本Olympus公司提供；熒光實時定量PCR 儀(型號：7500)由美國Life公司提供；多功能全波長酶標儀(型號：SpectraMaxi3)由美國MD公司提供。

1.3 實驗藥物

單味中藥丹參、葛根制備方法：將配制好的藥材使用清水浸泡30 min，然后將藥材加入到自動煎藥包裝機內(SANYANBZYl50K-1型，購買與天津三延精密機械有限公司)，先用武火煎煮30 min，然后轉文火煎制20 min，待藥液溫度轉涼使用獨立塑料袋進行包裝，并且將做好的藥包放置于-20℃的冰箱柜內保存，在使用時，將藥液取出加熱，耗掉大部分的水分，當藥液濃縮到合適濃度(丹參0.5 g/ml，葛根1.5 g/ml)，按照6.25 g·kg-1·d-1的濃縮液進行灌胃，療程為4周。

1.4 實驗方法

取32只雄性SD大鼠，按照隨機數(shù)字表法隨機分為4組，每組8只，分別為模型組、空白對照組、葛根對照組、丹參組。其中葛根對照組、丹參組每日給予相應單味藥物按照6.25 g·kg-1·d-1的濃縮液進行灌胃，模型組、空白對照組給予等體積生理鹽水灌胃，各組動物分別飼養(yǎng)4周。所有動物于第8周末麻醉后處死采血，收集肝臟組織稱重，進行Real-time PCR及肝臟指數(shù)指標檢測?？瞻讓φ战M喂飼普通飼料4周；模型組采用高脂飼料喂養(yǎng)4周以建立NAFLD大鼠模型。

1.5 標本采集

實驗完全結束(第8周)，各組大鼠禁食12～14 h，禁水2 h后，稱重，通過水合氯醛腹腔麻醉后，經腹主動脈采血20 ml，檢測血脂相關指標TC、TG、LDL-C、HDL-C；肝功能指標ALT、AST；細胞因子IL-6、IL-17、TNF-α的水平。取2 ml全血檢測Th17細胞；取出各組大鼠肝臟組織，稱重，計算肝臟指數(shù)；運用Trizol法從剩余的肝臟組織中提取肝臟總mRNA，檢測肝臟組織中RORγt基因表達；采用HE染色，觀察肝臟組織的病理學改變。

1.6 血脂相關指標檢測

取2 ml全血分離出血清和血漿，立即移至超低溫冰箱保存，使用全自動生化檢測儀按照試劑盒的操作說明檢測血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

1.7 肝功能指標檢測及肝組織病理學觀察

取2 ml全血分離出血清和血漿，立即移至超低溫冰箱保存，使用全自動生化檢測儀按照試劑盒的操作說明檢測血清ALT、AST水平。解剖取出各組大鼠肝臟，將新鮮的肝臟經過稱量重量計算肝臟指數(shù)后，取體積為2.0 cm×2.0 cm×0.2 cm的新鮮組織，將切好的標本固定于10%中性福爾馬林溶液中24 h，經酒精脫水和石蠟包埋后，將組織切成4 μm的薄片，而后展片、粘附、烤片。采用HE染色觀察肝臟組織病理學改變。

1.8 外周血Th17、Treg細胞含量檢測

Th17細胞抗體標記為FITC-抗CD4和PE-抗IL-17，CD4+IL-17+即為Th17含量；Treg細胞抗體標記為FITC-抗CD4和PE-抗CD25，CD4+CD25+即為Treg細胞含量。取2 ml肝素抗凝腹主動脈全血，分離出單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC) ，將細胞濃度設定為1×107cells/ml，置于溫度為37℃，濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。取出100 μl細胞懸液，分別加入0.5 μl FITC-抗CD4及0.5 μl PE-抗IL-17、PE-抗CD25，混勻，4℃避光孵育25 min。24 h內上流式細胞儀檢測。

1.9 血清Th17相關炎癥指標檢測

取2 ml全血分離出血清和血漿，立即移至超低溫冰箱保存，采用ELISA法檢測血清IL-6、IL-17、TNF-α水平，具體方法參照試劑盒操作說明。使用酶標儀讀取數(shù)據。

1.10 肝臟組織RORγt基因表達檢測

分別取各實驗組大鼠肝臟組織，Trizol法提取其總RNA，其OD260/ 280均在1.8～2.2。反轉錄反應體系為: Total RNA，4 μl；5×Buffer 4 μl，RT Enzyme MixⅠ 1 μl；RT Primer Mix 1 μl，RNase FreedH2O 0.25 μl，反應條件為：37℃15 min，85℃ 5 s。cDNA擴增反應體系為：cDNA 2 μl，RNase FreedH2O 20 μl，RORγt基因以及β-actin內參上下游引物序列0.5 μl(表1)，SYBR Premix Ex TaqⅡ 12.5 μl，反應條件：95℃10 min；95℃20 s，60℃ 20 s，40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計算樣品中 mRNA 含量，以β-Actin作為內參照計算樣品中 mRNA 相對表達量。計算各組大鼠RORγt mRNA 的表達量(△Ct值)，計算公式為：△Ct=目的基因Ct-內參照基因Ct。

Tab. 1 Gene primer sequences of RORγt

1.11 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 丹參對NAFLD大鼠血脂水平的影響

研究結果顯示，丹參治療組和葛根對照組大鼠TC、TG、LDL-C水平顯著低于模型組(P<0.05)；HDL-C水平顯著高于模型組(P<0.05)。丹參治療組TC、TG、LDL-C水平低于葛根對照組(P>0.05)；HDL-C水平高于葛根對照組(P>0.05, 表2)。

Tab. 2 Effects of Salvia mil on serum lipid levels in rats(mmol/L, n=8)

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group

2.2 丹參對NAFLD大鼠肝功能、肝臟指數(shù)及肝臟病理學的影響

2.2.1 丹參對NAFLD大鼠肝臟指數(shù)的影響 分別記錄空白對照組、模型組、葛根對照組、丹參治療組大鼠在實驗開始前的起始體重以及實驗結束時(8周末)的體重，以計算大鼠平均每周體重變化的重量。將大鼠處死后，取出肝臟組織并稱取重量，計算肝臟指數(shù)，公式為：肝臟指數(shù)=肝臟的重量/大鼠的重量。實驗結果顯示，丹參治療組、葛根對照組大鼠肝臟指數(shù)顯著低于模型組(P<0.05)；丹參治療組大鼠肝臟指數(shù)低于葛根對照組(P>0.05，表3)。

Tab. 3 Effects of Salvia mil on liver mass index in n=8)

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsmodel group

2.2.2 丹參對NAFLD大鼠肝功能的影響 實驗結果顯示，丹參治療組、葛根對照組大鼠ALT、AST水平顯著低于模型組(P<0.05)；丹參治療組大鼠ALT、AST水平顯著低于葛根對照組(P<0.05，表4)。

GroupALTASTControl33.8±3.762.9±4.3Model102.4±5.1?175.8±3.3?Pueraria control39.6±2.4#83.3±5.4?#Salvia mil35.6±2.3#Δ68.1±4.6#Δ

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsmodel group；ΔP<0.05vspueraria control group

2.2.3 丹參對NAFLD大鼠肝臟病理學的影響 正常對照組的肝細胞排列整齊，呈放射狀排列，核大而圓，胞質均勻，位于細胞的中央，肝小葉形狀規(guī)則而完整，肝細胞未見脂肪變；與正常對照組相比，模型組肝細胞排列不規(guī)則，體積明顯增大，肝小葉消失，在肝細胞質內有大量的脂滴空泡，并可見大量的炎性灶，說明NAFLD模型復制成功；葛根對照組大鼠肝細胞排列整齊，呈條索狀排列，核圓居中，細胞質均勻無脂肪變，肝小葉形狀規(guī)則完整；丹參治療組大鼠肝細胞排列整齊，呈條索狀排列，核圓局中，細胞質均勻無脂肪變，炎性灶明顯減少，肝小葉形狀規(guī)則完整，肝竇正常。

2.3 丹參對NAFLD大鼠外周血Th17、Treg細胞含量的影響

實驗結果顯示，丹參治療組、葛根對照組大鼠外周血Th17細胞含量顯著低于模型組(P<0.05)；Treg細胞含量、Treg/ Th17比例顯著高于模型組(P<0.05)；丹參治療組大鼠Th17細胞含量顯著低于葛根對照組(P<0.05)；Treg/ Th17比例顯著高于葛根對照組(P<0.05，表5)。

GroupTh17(%)Treg(%)Treg/ Th17Control1.46±0.144.59±0.213.14±0.26Model3.50±0.16?3.71±0.22?1.06±0.24?Pueraria control1.69±0.20#4.52±0.19#2.67±0.26#Salvia mil1.58±0.18#Δ4.58±0.18#2.91±0.25#Δ

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsmodel group；ΔP<0.05vspueraria control group

2.4 丹參對NAFLD大鼠Th17相關炎癥指標及肝組織RORγt基因表達的影響

實驗結果顯示，丹參治療組、葛根對照組大鼠IL-6、IL-17、TNF-α水平顯著低于模型組(P<0.05)；丹參治療組大鼠IL-6、IL-17水平顯著低于葛根對照組(P<0.05)；丹參治療組、葛根對照組大鼠RORγt基因表達量顯著低于模型組；丹參治療組大鼠RORγt基因表達量顯著低于葛根對照組(P<0.05，表6)。

Tab. 6 Effects of Salvia mil on the levels of IL-6, IL-17 and TNF-α in n=8)

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group；ΔP<0.05vspueraria control group

3 討論

NAFLD主要是由于甘油三酯在肝內過度堆積而引發(fā)的肝臟疾病，目前已成為我國乃至全球性的嚴重公共衛(wèi)生問題[8]。目前NAFLD的發(fā)病機制并不明確，因此，深入探索NAFLD的發(fā)病機制，并尋找行之有效的治療方法具有非常重要的臨床意義。本次實驗通過高脂喂飼4周，模型組大鼠的血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C)水平、肝功能損傷特異性標記物(AST、ALT)水平顯著升高，肝臟發(fā)生脂肪變性，有大量炎癥細胞浸潤，成功復制了NAFLD大鼠模型，中醫(yī)認為“脾虛肝郁，痰濁瘀阻”是NAFLD的關鍵病機[9]，丹參具有養(yǎng)血護肝、活血化瘀作用，在NAFLD的治療中應用非常廣泛，是應用頻率較高的藥物。既往研究表明，丹參能夠促進脂肪在肝中氧化、降低肝臟脂肪含量并明顯改善NAFLD大鼠的肝臟脂質沉積[10]。丹參酮ⅡA作為中藥丹參的主要有效成分之一，能夠通過調節(jié)CD4+T細胞及IL-17等炎癥因子，從而發(fā)揮調節(jié)機體免疫功能及抗炎等作用[11,12]。

目前越來越多的研究表明，NAFLD與機體的免疫功能及炎癥細胞因子失衡密切相關[13]，Th17細胞和Treg細胞的失衡是其主要病理機制之一。Th17細胞是CD4+淋巴細胞重要亞群，參與多種炎癥性及免疫性疾病，能夠誘導上皮細胞分泌IL-6、IL-17以及TNF-α等促炎因子，進而促進炎癥反應、肝細胞炎癥及脂肪變性的發(fā)生發(fā)展，而Treg細胞具有免疫抑制作用，主要參與免疫應答或免疫抑制的調控[14,15]。本次實驗結果表明丹參治療組大鼠外周血Th17細胞含量顯著低于模型組及葛根對照組；Treg細胞含量高于模型組及葛根對照組；丹參治療組大鼠IL-6、IL-17、TNF-α水平均低于模型組及葛根對照組，且IL-6、IL-17水平下降尤為明顯。說明丹參能夠通過降低Th17細胞含量，進而減少IL-6、IL-17、TNF-α的分泌，抑制肝臟炎癥反應及脂肪變性，從而發(fā)揮療效。RORγt是維甲酸相關核孤兒受體的家族成員之一，是Thl7分化的特異性關鍵轉錄因子，CD4+T細胞能夠STAT3通路調控RORγt向Th17分化，RORγt的缺失會導致Thl7的分化缺失[16]。本次實驗結果顯示，丹參治療組大鼠RORγt基因表達量顯著低于模型組及葛根對照組，說明丹參能夠通過降低RORγt基因表達而抑制Th17分化。

綜上所述，單味中藥丹參通過降低血清中IL-6、IL-17、TNF-α水平，抑制RORγt基因表達，降低外周血Th17細胞含量，升高Treg細胞含量，調整Th17/Treg平衡，進而發(fā)揮有效防治NAFLD發(fā)生發(fā)展的作用。這為丹參臨床治療非酒精性脂肪肝提供一定的實驗依據