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氯化兩面針堿對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的干預(yù)作用及其機(jī)制*

2019-04-15 05:30:18吳亞俐劉凱麗崔香麗王春芳
關(guān)鍵詞:兩面針隱窩潰瘍性

吳亞俐,劉 鑫,劉凱麗,崔香麗△,王春芳

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系,2.山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,山西 太原 030001)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎兩種疾病類型,在西方國家發(fā)病率很高,在我國發(fā)病率也呈上升趨勢[1]。目前治療UC的藥物主要包括抗炎藥和免疫抑制劑[2],但是這些療法具有嚴(yán)重的副作用,如易復(fù)發(fā)、長期藥物副作用、難治性特點限制了其臨床應(yīng)用。因此,研究者希望能找到既無毒無副作用、又能預(yù)防或治療結(jié)腸炎的藥物。據(jù)估計,40%的IBD患者使用某種形式的中藥提取物[3,4]。兩面針堿是提取自蕓香科花椒屬植物兩面針根部的一種天然植物活性生物堿。研究表明,氯化兩面針堿(nitidine chloride,NC)有多種生物活性,包括抗炎,抗瘧,抗菌,止痛及抗癌活性。作為一種傳統(tǒng)草藥,NC在治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牙周炎和膿皰病等方面有著廣泛的應(yīng)用[5]。然而,NC對于潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制鮮有報導(dǎo)。MicroRNAs(MiRNAs)是一類小的、內(nèi)源性的、非編碼的RNA分子,是動物和植物中的一種進(jìn)化保守的分子。它通過靶向mRNA來抑制或降解蛋白質(zhì),從而在轉(zhuǎn)錄后控制蛋白質(zhì)的產(chǎn)生[6]。研究表明,miRNAs在IBD的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[6],且miRNAs在潰瘍性結(jié)腸炎的結(jié)腸組織中有差異性表達(dá)。本研究使用DSS誘發(fā)小鼠腸炎模型探討氯化兩面針堿治療腸炎的可能性,并將結(jié)腸炎組織中異常表達(dá)的miR-31作為研究靶點,觀察NC通過miR-31作用的可能機(jī)制,為潰瘍性結(jié)腸炎的治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

SPF級雄性C57BL/6小鼠30只,6~8 周齡,體質(zhì)量為22~25 g,購自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。DSS購自美國 MP公司。氯化兩面針堿(nitidine chloride,NC,純度≥98%) 購自上海同田生物科技有限公司。羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購自天津恒興試劑公司。高鐵飼料購自北京華阜康生物公司。RNA提取,反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增相關(guān)的試劑盒購自德國Qiagen公司。NF-κB p65兔單克隆一抗購自于美國Cell Signaling公司,COX-2兔單克隆一抗購自于美國Cell Signaling公司,β-actin鼠單克隆一抗購自武漢Proteintech公司,HRP標(biāo)記羊抗兔IgG 二抗購自北京全式金公司,兔抗小鼠IgG二抗購自美國Cell Signaling公司。

1.2 小鼠DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型的建立

30只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為Control組(n=7),DSS組(n=8),DSS+NC組(n=8),NC組(n=7)。6~8周齡的小鼠進(jìn)行無菌水或1%DSS 3周的喂養(yǎng),且Control組和NC組小鼠均進(jìn)食對照飼料,同時DSS組和DSS+NC組進(jìn)食高鐵飼料。膳食補充鐵劑可增強DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎和相關(guān)的大腸癌的發(fā)展,這是因為鐵劑是通過增加氧化應(yīng)激和亞硝化應(yīng)激來增強UC的發(fā)展。造模開始前進(jìn)行稱重并標(biāo)記所有小鼠。其中Control組和NC組小鼠每天飲用正常無菌水,飲用3周;DSS組和DSS+NC組小鼠第1日飲用DSS水,且每隔2 d換一次新鮮的DSS水,在第8日換為正常無菌水,一周后繼續(xù)重復(fù)上述的DSS水喂養(yǎng)一周。在造模最后一周給予各組小鼠灌胃,其中正常對照組和DSS組給予 0.2 ml的0.5% CMC-Na灌胃,DSS+NC組和NC組給予 0.2 ml的0.8 mg/ml濃度的NC灌胃(圖1)。造模完成后,小鼠稱重,安樂死。移除脾臟測量重量并計算脾指數(shù),摘取小鼠結(jié)腸,用1磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗,縱切,測量長度后放入4%多聚甲醛中浸泡24 h,卷成瑞士卷,之后進(jìn)行石蠟包埋,切片,進(jìn)行HE染色。其余結(jié)腸組織立即置-80℃超低溫冰箱中保存待用。脾指數(shù)=脾臟質(zhì)量/小鼠體重。

Fig. 1 Establishment of ulcerative colitis model in DSS mice

1.3 疾病活動度評分

造模期間每天記錄每組小鼠的體質(zhì)量、大便性狀及便血情況,計算疾病活動指數(shù) (disease activity index,DAI) 評分,將3項結(jié)果的總分除以3即得到DAI值。即DAI =(體質(zhì)量下降+大便粘稠度+隱血情況)/3(表1)。

Tab. 1 Disease activity index

1.4 結(jié)腸組織HE染色

結(jié)腸組織石蠟包埋后切 5 μm 片,依次將切片置于蘇木素和伊紅染液中染色,脫水透明,中性樹膠封片。顯微鏡下觀察各組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)改變。

1.5 結(jié)腸組織病理學(xué)評分

將結(jié)腸組織切片進(jìn)行HE染色后,在顯微鏡下觀察炎癥損傷程度并進(jìn)行組織損傷程度評級。此評級總共涉及四部分:炎癥程度,炎癥深度,隱窩損傷程度,還有炎癥范圍。組織學(xué)評分是通過以下3項組織學(xué)特征中的每一項的受累百分比乘以炎癥范圍來確定的。炎癥程度(0,無;1,輕度;2,中度;3,重度),炎癥深度(0,無;1,黏膜;2,黏膜和黏膜下層;3,漿膜層)以及隱窩損傷程度(0,無;1,基底三分之一的隱窩受損;2,基底三分之二的隱窩受損;3,隱窩消失,僅有完整的表面上皮;4,全部隱窩及上皮破壞)。炎癥范圍百分比定義為:0,0%;1,1%~25%;2,26%~50%;3,51%~75%;4,76%~100%。因此,最小得分為0,最大得分為40分。

1.6 qPCR檢測小鼠結(jié)腸組織miR-31的表達(dá)

按miRNeasy Mini Kit說明書提取小鼠結(jié)腸組織總RNA。用NanoDrop 2000c分光光度計(Thermo,美國)測定RNA濃度和穩(wěn)定性。應(yīng)用miScript II RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Qiagen,德國),以200 ng總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后使用miScript SYBR Green PCR Kit擴(kuò)增以mmu-miRNA-31為引物的miR-31的表達(dá)以及內(nèi)參RNU6B(U6)的表達(dá),反應(yīng)體系在CFX96(Bio-Rad,美國)上機(jī)對miR-31和U6進(jìn)行實時定量PCR檢測。根據(jù)miR-31和U6的閾值(CT)測定miR-31表達(dá)與U6表達(dá)的相對倍數(shù)變化。所有樣品一式三份。

1.7 Western blot 檢測NF-κB p65、COX-2蛋白的表達(dá)

取結(jié)腸組織約50 mg,用RIPA裂解緩沖液裂解蛋白,BCA法測定蛋白質(zhì)總濃度。取含總蛋白20 μg的結(jié)腸組織勻漿液10 μl,SDS-PAGE電泳后,用半干法將蛋白分子轉(zhuǎn)移至PVDF膜上;5%脫脂奶粉( 0.25 g脫脂奶粉+5 ml TBST)封閉2 h,洗膜后分別注入羊抗兔NF-κB p65一抗(1∶1 000)、羊抗兔 COX-2一抗(1∶1 000)、羊抗小鼠β-actin一抗(1∶1 000),2 h后回收一抗,洗膜后注入HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶2 000)或兔抗小鼠IgG(1∶2 000)二抗,室溫孵育1 h;ECL顯影,Bio-Rad Image Lab凝膠成像系統(tǒng)顯影,并對Western blot條帶進(jìn)行定量分析,確定目的條帶的灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 DAI評分

造模過程中,Control組和NC組小鼠體質(zhì)量均無降低,無潛血陽性,DSS組小鼠體質(zhì)量下降明顯,在第2日開始出現(xiàn)潛血試驗陽性,在第3周出現(xiàn)血便并逐漸加重,與Control組相比,DAI評分顯著增加(P<0.01);DSS+NC組體質(zhì)量、便血情況較DSS組程度顯著減輕(P<0.01,表2)。

2.2 小鼠的結(jié)腸長度

所有小鼠取結(jié)腸后,將結(jié)腸縱行剖開,用大頭針固定結(jié)腸前端和后端使用直尺測量長度。測量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,表2結(jié)果顯示與Control組比較,DSS組小鼠結(jié)腸長度明顯縮短(P<0.01);與DSS組比較,NC治療組結(jié)腸長度均顯著增加(P<0.01);NC組結(jié)腸長度與Control組相比沒有差異。

GroupnDAI scoreLength (cm)Control70.476±0.1237.357±0.244DSS82.250±0.137??6.213±0.244??DSS+NC81.000±0.154##7.100±0.134##NC70.333±0.1467.443±0.107

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDSS

2.3 小鼠脾臟質(zhì)量和脾指數(shù)的變化

除切除小鼠結(jié)腸外,我們還切除了小鼠的脾臟,初步觀察其免疫功能的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DSS組小鼠脾臟質(zhì)量和脾指數(shù)相比于正常對照組都明顯增大(P<0.01);給予NC治療后,脾臟質(zhì)量和脾指數(shù)都有所降低(P<0.05,表3)。

GroupnSpleen(g)Spleen index(g/g)Control70.079±0.0100.0033±0.0004DSS80.238±0.038??0.0111±0.0020??DSS+NC80.131±0.008#0.0063±0.0004#NC70.110±0.0140.0046±0.0010

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsDSS

2.4 小鼠結(jié)腸HE染色結(jié)果

四組小鼠的結(jié)腸HE染色結(jié)果顯示DSS組小鼠腸炎嚴(yán)重,鏡下可見黏膜及黏膜下層明顯的炎性細(xì)胞的浸潤,腸壁增厚,隱窩排列紊亂,上皮及隱窩破壞明顯(圖2B);NC治療組小鼠結(jié)腸黏膜較DSS組破壞輕,結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)大致完整(圖2C)。通過計算各組的結(jié)腸組織病理學(xué)評分可知:與Control組 (3.571±1.395)比較(圖2A),DSS組(23.250± 1.868)評分顯著升高(P<0.01);與DSS組比較,NC治療組(6.375±1.224)評分顯著降低(P< 0.01);單獨給予NC組(3.714±1.229)和Control組小鼠組織損傷評分總分無顯著差異(圖2D,圖2見彩圖頁Ⅱ)。

2.5 小鼠結(jié)腸組織miR-31的表達(dá)

QPCR結(jié)果顯示,與Control組相比,DSS組結(jié)腸組織miR-31的表達(dá)明顯升高(P<0.01);給予NC治療后,與DSS組相比,DSS+NC組小鼠結(jié)腸組織miR-31的表達(dá)降低(P<0.05);與Control組相比,NC組小鼠結(jié)腸組織miR-31表達(dá)減少(P<0.01)。說明潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸miR-31表達(dá)上調(diào),而氯化兩面針堿可以下調(diào)小鼠結(jié)腸組織中miR-31的表達(dá)(表4)。

2.6 Western blot檢測小鼠結(jié)腸組織內(nèi)炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)

與Control組比較,DSS組的小鼠結(jié)腸組織NF-κB p65 (P<0.01,圖3A,表4)以及COX-2(P< 0.01,圖3B,表4)蛋白的表達(dá)水平升高;給予NC治療后,DSS+NC組的NF-κB p65(P<0.05,圖3A,表4),COX-2(P<0.05,圖3B,表4)蛋白表達(dá)水平有所降低。NC組NF-B p65(圖3A,表4)蛋白表達(dá)與Control組相比無顯著差異;NC組COX-2蛋白表達(dá)與Control組相比顯著降低(P<0.01,圖3B,表4)。

Fig. 3 Expressions of NF-κB and COX-2 protein in colonic tissue of mice

A: Detection of NF-κB protein expression by Western blot; B: Detection of COX-2 protein expression by Western blot

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsDSS

3 討論

氯化兩面針堿(NC)是一種生物堿,具有抗炎,抗菌,止痛及抗癌等活性。 Wang等人證明NC通過NF-κB和MAPK信號通路調(diào)節(jié)LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-1b和IL-6的釋放[7],發(fā)揮抗炎作用。本研究表明NC對C57BL/6小鼠DSS誘導(dǎo)的UC具有抗炎作用,改善了小鼠的炎癥癥狀及組織損傷,為NC治療潰瘍性結(jié)腸炎的新藥研發(fā)提供基礎(chǔ)。

口服DSS溶液在小鼠體內(nèi)建立UC模型,其病理變化與人UC相似[8]。因此本文在此方面建立小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型,評估了DSS誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠的DAI評分、結(jié)腸長度、脾臟質(zhì)量和脾指數(shù)的改變以及組織學(xué)變化。DAI評分反映了DSS所致結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度。包括體重減輕、大便出血和腹瀉[9]等小鼠的不適狀況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,DSS處理的結(jié)腸炎小鼠DAI明顯增加,結(jié)腸長度縮短。與DSS組相比,經(jīng)NC處理的小鼠在誘導(dǎo)結(jié)腸炎后,DAI明顯減少。結(jié)腸長度是反映炎癥嚴(yán)重程度一個間接指標(biāo),與DSS引起的UC的嚴(yán)重程度成反比。本實驗觀察到與DSS組相比,NC治療組小鼠結(jié)腸長度明顯恢復(fù)。DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎發(fā)生后,引起了小鼠脾臟質(zhì)量和脾指數(shù)的增加。組織學(xué)觀察進(jìn)一步證實NC的保護(hù)作用。DSS誘導(dǎo)引起小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)改變,表現(xiàn)為大量炎細(xì)胞浸潤和隱窩結(jié)構(gòu)紊亂,腸壁增厚。但NC治療后可明顯減輕DSS引起的腸道組織破壞及其相關(guān)炎癥變化,從而改善炎癥狀態(tài)。以上結(jié)果提示,NC可阻斷小鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng),對DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎有明顯的治療作用。

盡管近年來對IBD進(jìn)行了大量的研究,但缺乏發(fā)現(xiàn)IBD的生物標(biāo)記物。MicroRNAs(MiRNAs)被認(rèn)為是多種疾病的預(yù)測因子,包括癌癥、心血管病以及炎癥性疾病[10-13]。近來研究表明miR-31的調(diào)控異常參與多種疾病的發(fā)病機(jī)制。例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的慢性滑膜炎癥依賴于T細(xì)胞的遷移和保留,miR-31在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜液中的T細(xì)胞中表達(dá)是上調(diào)的,miR-31基因敲除可導(dǎo)致細(xì)胞骨架重排和運動相關(guān)基因的上調(diào)[14]。據(jù)報道,在一組伴有微血管并發(fā)癥的2型糖尿病患者中,血清中miR-31的表達(dá)是上調(diào)的[15]。Wang等人發(fā)現(xiàn)在冠心病(CAD)患者中,血清miR-31水平降低,這種下調(diào)可導(dǎo)致冠心病的發(fā)病[16]。對IBD病人進(jìn)行結(jié)腸黏膜活檢發(fā)現(xiàn)炎癥組織與正常組織有差異表達(dá)的miRNAs譜[17-21]。并且我們實驗室前期對于潰瘍性結(jié)腸炎病人的潰瘍組織與臨近正常組織測序發(fā)現(xiàn),miR-31-5p是上調(diào)最明顯的miRNAs之一。因此,本實驗將miR-31作為深入了解結(jié)腸上皮炎癥病理生理機(jī)制的分子靶標(biāo)。在本研究中,通過對結(jié)腸組織miR-31 qPCR檢測發(fā)現(xiàn),DSS組的miR-31的表達(dá)量比正常對照組增高1.13倍,這與本實驗室之前的測序結(jié)果一致。給予NC治療后,miR-31的表達(dá)水平降低了0.4倍,提示NC可能是通過下調(diào)miR-31的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用。

研究表明在結(jié)腸炎組織中NF-κB是組成性激活的[22],而目前對于與IBD相關(guān)的miR-31與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB之間關(guān)系的研究較少。本研究表明,與正常對照組相比,DSS組的NF-κB的蛋白表達(dá)是升高的;這與DSS組中miR-31的高表達(dá)趨勢一致。而給予NC治療之后,NF-κB蛋白的表達(dá)下調(diào),改善小鼠的腸道炎癥;同樣地,該組的miR-31的表達(dá)水平也降低。有研究發(fā)現(xiàn),在銀屑病中,miR-31可以通過靶向抑制其靶蛋白絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶40(STK40)提高NF-κB蛋白的表達(dá)[23]。結(jié)合我們的結(jié)果,NC發(fā)揮抗結(jié)腸炎的作用可能是通過靶向調(diào)節(jié)miR-31從而調(diào)節(jié)NF-κB信號通路實現(xiàn)的。NF-B 是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,能與許多基因的啟動子和增強子中B轉(zhuǎn)錄序列發(fā)生特異性結(jié)合,啟動轉(zhuǎn)錄[24]?;罨腘F-κB通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控炎癥相關(guān)基因,如COX-2[25],從而影響炎癥性疾病的特征。本研究證實給予NC治療之后,COX-2蛋白的表達(dá)水平降低。據(jù)報道COX-2是結(jié)腸炎的關(guān)鍵介導(dǎo)因子[26]。因此NC治療DSS誘發(fā)結(jié)腸炎的作用與抑制COX-2有關(guān),其詳細(xì)的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

氯化兩面針堿對DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎有明顯的治療作用,其抗炎機(jī)制與下調(diào)miR-31的表達(dá)有關(guān)。這為潰瘍性結(jié)腸炎的治療提供新的研究方向,但是其臨床應(yīng)用問題尚待進(jìn)一步研究。目前治療結(jié)腸炎的藥物多種多樣,但其各自發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制不同,作用效果也各不相同。本研究著眼于分子靶點的探究,將miR-31作為氯化兩面針堿發(fā)揮抗炎作用的分子靶點,從而下調(diào)炎癥信號通路,從基因水平為結(jié)腸炎的治療提供精準(zhǔn)用藥,降低藥物的副作用,更大程度地發(fā)揮抗炎作用。

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