肖雙凱,張江松,焦俊玥,趙逸彬,林咸明

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一種天灸發(fā)泡大鼠模型的建立與評(píng)價(jià)

肖雙凱,張江松,焦俊玥,趙逸彬,林咸明

(浙江中醫(yī)藥大學(xué),杭州 310053)

探索一種穩(wěn)定的天灸發(fā)泡大鼠模型的制作方法。將8只雄性SD大鼠麻醉、脫毛,稱取0.018 g棉球填充于PU防水空白膏藥貼中央。吸取200mL 5%斑蝥酊均勻浸濕棉球后貼敷刺激,2 h后加200mL斑蝥酊1次,密封覆蓋,4 h后統(tǒng)一收集泡液。通過(guò)觀察發(fā)泡率、泡體大小、泡液量、泡液吸收情況、發(fā)泡區(qū)域結(jié)痂情況、大鼠死亡率情況以及發(fā)泡液內(nèi)總細(xì)胞數(shù)量,對(duì)本方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。200mL 5%的斑蝥酊發(fā)泡率高,泡液量和泡體大小較理想,大鼠死亡率低。用200mL 5%的斑蝥酊可以在大鼠皮膚進(jìn)行穩(wěn)定發(fā)泡,且操作便捷,大鼠死亡率低。

發(fā)泡療法;天灸;斑蝥酊;模型,大鼠;灸法

天灸,也稱發(fā)泡灸,是采用刺激性較強(qiáng)的中藥貼敷在皮膚特定穴位,使局部發(fā)熱、充血、發(fā)紅、發(fā)泡甚至化膿的一種外治方法[1]。本法具有調(diào)節(jié)免疫的作用。目前,國(guó)內(nèi)外關(guān)于天灸的研究,多建立在以人為對(duì)象的臨床和實(shí)驗(yàn)研究[2]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究方面,以白芥子或斑蝥穴位貼敷至皮膚充血發(fā)紅來(lái)研究血清居多[3-4],鮮見(jiàn)大鼠天灸泡液成分和局部皮膚病理改變的研究,這與缺乏穩(wěn)定的大鼠天灸發(fā)泡模型有關(guān)。模型的建立對(duì)天灸的臨床發(fā)展和機(jī)制研究必不可少[5]。為解決這一問(wèn)題,本實(shí)驗(yàn)選擇Sprague-Dawley(SD)大鼠,對(duì)傳統(tǒng)的大鼠天灸方法進(jìn)行了改進(jìn)和比較研究,探索出一種穩(wěn)定的大鼠天灸方法,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用健康雄性清潔級(jí)SD大鼠,體質(zhì)量為(250±10)g,購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)SCXK(浙)2014- 0001],由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。

1.2 材料與試劑

5 cm×5 cm內(nèi)圈1 cm新型PU防水空白膏藥貼、PU防水膜(連云港三瑞醫(yī)療器械制造有限公司);斑蝥粉(華東醫(yī)藥公司,批號(hào)100722);薇婷脫毛膏(利潔時(shí)家化有限公司);95%乙醇(上海展云化工有限公司);雙圈定性濾紙(杭州沃華濾紙有限公司)。

1.3 發(fā)泡方法

①5%斑蝥酊的配制,將5 g生藥斑蝥粉浸泡在95%乙醇中,定容至100 mL,7 d后過(guò)濾,4℃保存;②大鼠發(fā)泡區(qū)域的備皮,大鼠腹腔麻醉后,于項(xiàng)部?jī)啥蠹怪鶅膳缘染嚯x、等面積用薇婷脫毛膏脫毛4 cm2,用生理鹽水清潔后在大鼠恒溫臺(tái)上安置,室溫控制在26℃;③發(fā)泡藥貼的準(zhǔn)備,稱取0.018 g棉球填充于發(fā)泡藥貼的中央,輕輕按壓,以棉球剛好填充滿且不高突于發(fā)泡藥貼的中心圈為度。

1.4 PU防水膜棉球壓充法

上述準(zhǔn)備工作完成后,吸取200mL 5%斑蝥酊均勻浸濕棉球后,貼敷于大鼠待發(fā)泡區(qū)域。發(fā)泡藥貼四周貼膜應(yīng)當(dāng)均勻,防止藥物揮發(fā)。2 h后加200mL斑蝥酊1次,密封覆蓋。用PU防水膜密封并繼續(xù)觀察2 h,并于4 h時(shí)統(tǒng)一收集泡液。操作者小心從中間區(qū)域剪下PU防水膜,用鑷子夾出棉球并沿著發(fā)泡藥貼的內(nèi)側(cè)緣小心提起,觀察發(fā)泡情況。剪掉其余發(fā)泡藥貼的中心圈,保留其周?chē)c大鼠皮膚黏合的部分,以防止發(fā)泡區(qū)域及周?chē)つw表皮層因發(fā)泡后疏松而意外脫落,泡液流失。室溫放置,游標(biāo)卡尺測(cè)量泡體的長(zhǎng)短軸大小。詳見(jiàn)圖1A。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 一般情況觀察

觀察并記錄大鼠發(fā)泡前后活動(dòng)反應(yīng)能力、毛發(fā)情況、精神狀況、排便和日常行動(dòng)等一般狀況。

1.5.2 記錄發(fā)泡率和大小

4 h后統(tǒng)一取下發(fā)泡藥貼,立即記錄發(fā)泡數(shù)量,并測(cè)量泡體大小。泡體大小由游標(biāo)卡尺測(cè)量長(zhǎng)短軸,計(jì)算出泡體皮膚接觸面的面積(精確到0.1 cm2)。圓面積公式為S=p(圓周率)×r2,其中π表示圓周率,r表示半徑;橢圓面積公式為S=p×a×b,其中a、b分別是橢圓的半長(zhǎng)軸和半短軸的長(zhǎng)。

1.5.3 觀察泡液量

用量程為20～200mL的移液槍小心抽取泡液,并保存在EP管中,記錄每只大鼠泡液量。

1.5.4 記錄泡液總細(xì)胞數(shù)量

泡液收集后用血球計(jì)數(shù)盤(pán)來(lái)計(jì)數(shù)泡液中總細(xì)胞數(shù)量,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.5.5 大鼠存活率

發(fā)泡后,持續(xù)觀察大鼠1周,如有死亡則立即記錄死亡時(shí)間。

1.5.6 觀察發(fā)泡區(qū)域皮膚變化狀況

發(fā)泡后大鼠單籠飼養(yǎng),1周內(nèi)持續(xù)觀察,如有結(jié)痂、潰爛、紅腫和感染等情況,應(yīng)詳細(xì)記錄時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 大鼠天灸前后一般情況變化

天灸前,大鼠皮毛均光澤順滑,精神狀態(tài)佳,行動(dòng)敏捷,體質(zhì)量穩(wěn)定增長(zhǎng)、糞尿正常。天灸后,直到24 h泡液完全吸收之間,大鼠狂躁多動(dòng),四處攀爬,瘙抓發(fā)泡區(qū)域。泡液完全吸收至3 d內(nèi),上述情況逐漸改善,但體重增長(zhǎng)十分緩慢,部分大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降,飲食減少,并表現(xiàn)為豎毛、雜亂,毛色失去光澤。大鼠精神差,活動(dòng)減少,行動(dòng)遲緩。第4天開(kāi)始,上述情況逐漸恢復(fù),一直到第7天,大鼠各項(xiàng)生理狀況基本恢復(fù)至天灸前。

2.2 大鼠發(fā)泡率和存活率情況

8只大鼠貼敷4 h后成功發(fā)泡7只,發(fā)泡率為87.5%。7 d后,8只大鼠均存活,存活率為100%。詳見(jiàn)表1。

2.3 泡體大小情況

通過(guò)對(duì)泡體的測(cè)量,發(fā)現(xiàn)各大鼠發(fā)泡大小差異性大,最小可如米粒般,最大可以充滿整個(gè)發(fā)泡藥貼的空間,尚不能人為控制。詳見(jiàn)表1、圖1B。

2.4 泡液量情況

在已發(fā)泡的7只大鼠中,有5只可以成功抽取泡液,最大泡液量為200mL,其泡體的大小和泡液量基本呈現(xiàn)正相關(guān)。詳見(jiàn)表1。

2.5 泡液總細(xì)胞數(shù)量情況

泡液收集后進(jìn)行統(tǒng)一稀釋,用血球計(jì)數(shù)盤(pán)計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn)泡液總細(xì)胞數(shù)基本相同,為5×106/mL,并且鏡下細(xì)胞數(shù)量密集。

2.6 發(fā)泡區(qū)域皮膚變化狀況

經(jīng)觀察,發(fā)泡區(qū)域皮膚主要出現(xiàn)結(jié)痂情況,伴隨著紅腫的出現(xiàn),無(wú)潰爛和感染。大鼠結(jié)痂伴隨著發(fā)泡的出現(xiàn)而出現(xiàn),不發(fā)泡大鼠沒(méi)有出現(xiàn)結(jié)痂情況。從48 h開(kāi)始,逐漸開(kāi)始有結(jié)痂出現(xiàn);第3天(72 h前后)均有不同程度的結(jié)痂,痂塊中心區(qū)域顏色暗紅,周?chē)t并稍透明;5 d后大部分脫落;7 d后基本完全脫離。脫落后,大鼠發(fā)泡區(qū)域皮膚逐漸恢復(fù)正常,開(kāi)始有部分新生毛發(fā)。詳見(jiàn)圖1C。

天灸對(duì)不同發(fā)泡時(shí)長(zhǎng)的大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均有直接影響,突出表現(xiàn)在①正常大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)完整,表皮層次、基底層、棘層以及顆粒細(xì)胞層的構(gòu)成和排列都清晰,連續(xù)且完好。詳見(jiàn)圖1D。②當(dāng)天灸刺激,水泡出現(xiàn)時(shí),經(jīng)HE染色觀察到皮膚顆粒層增厚(見(jiàn)圖1Ea);棘層松解,棘細(xì)胞間水腫(見(jiàn)圖1Eb);基底層細(xì)胞變性,柱狀上皮細(xì)胞變性,形態(tài)改變(見(jiàn)圖1Ec);炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以嗜酸性粒細(xì)胞為主,開(kāi)始浸潤(rùn)(見(jiàn)圖1Ed)。③當(dāng)水泡消失,發(fā)泡區(qū)域結(jié)痂后,發(fā)現(xiàn)表皮脫落,棘層、顆粒層和基底層細(xì)胞均缺失,痂塊出現(xiàn)(見(jiàn)圖1Fa);嗜酸性粒細(xì)胞大量浸潤(rùn)(見(jiàn)圖1Fb)。

表1 5%斑蝥酊大鼠發(fā)泡情況

3 討論

目前從國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)來(lái)看,天灸的發(fā)泡方法多以白芥子配合其他刺激性藥物共同研末成藥餅貼敷穴位[6],或以白芥子、斑蝥單獨(dú)貼敷發(fā)泡[7],國(guó)內(nèi)也有用斑蝥末和凡士林制成斑蝥膏發(fā)泡[8];國(guó)外研究則多以斑蝥素發(fā)泡為主[9-11],或用負(fù)壓拔罐的方法在人前臂進(jìn)行發(fā)泡研究[12]。以上研究均是以人為對(duì)象進(jìn)行天灸發(fā)泡,且發(fā)泡穩(wěn)定,在此基礎(chǔ)上的許多研究有力地推動(dòng)了傳統(tǒng)天灸療法的發(fā)展。但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究方面尚未見(jiàn)到詳細(xì)的天灸發(fā)泡方法,有報(bào)道用不同濃度的斑蝥酊刺激大鼠皮膚,但仍難以看到水泡[13],這和動(dòng)物與人皮膚的差異性、發(fā)泡方法、發(fā)泡藥物和發(fā)泡材料的選擇等諸多因素有關(guān),也在一定程度上限制了天灸的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)以上天灸方法進(jìn)行總結(jié)、對(duì)比[8],經(jīng)過(guò)前期大量預(yù)實(shí)驗(yàn),最終選擇用斑蝥酊發(fā)泡,并篩選出了斑蝥酊發(fā)泡的最佳濃度和獨(dú)特方法,可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定發(fā)泡,具有很大優(yōu)勢(shì)。在發(fā)泡材料的選擇方面,本課題組認(rèn)為大鼠發(fā)泡關(guān)鍵在于持續(xù)的皮膚刺激,藥物的刺激只是一個(gè)方面,且只有在藥物與皮膚接觸面有較充足的空間時(shí)才能發(fā)泡。否則,泡液將會(huì)滲透入疏松的皮膚表皮層而難以見(jiàn)到泡體。故本實(shí)驗(yàn)用浸濕的棉團(tuán)作為填充材料,這樣既實(shí)現(xiàn)了斑蝥酊的持續(xù)性刺激作用,又保證了充足的空間,這是發(fā)泡的關(guān)鍵因素。對(duì)于重復(fù)加藥方法的確定,筆者發(fā)現(xiàn)單次給于斑蝥酊并不能發(fā)泡,這可能是由于斑蝥酊經(jīng)過(guò)皮膚滲透逐漸吸收之后,發(fā)泡藥貼中剩余斑蝥酊劑量不足,不能起到持續(xù)性的皮膚表面刺激。故筆者經(jīng)過(guò)進(jìn)一步嘗試,在2 h時(shí)加藥1次,保證了持續(xù)性的藥物刺激,最終獲得了穩(wěn)定的發(fā)泡。

在天灸發(fā)泡的評(píng)價(jià)指標(biāo)方面,因本實(shí)驗(yàn)是以大鼠為對(duì)象進(jìn)行的發(fā)泡,在此之前,國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均無(wú)明確、詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)性大鼠天灸發(fā)泡的報(bào)道,故并無(wú)有針對(duì)性的詳細(xì)分類和判定標(biāo)準(zhǔn)。但筆者通過(guò)參考借鑒相關(guān)臨床研究[7],初步擬定了以大鼠為研究對(duì)象天灸發(fā)泡的評(píng)價(jià)指標(biāo),即以發(fā)泡率、泡體與皮膚接觸面積、泡液量、泡液吸收情況、發(fā)泡區(qū)域結(jié)痂情況、死亡率情況以及泡液總細(xì)胞數(shù)量,對(duì)本天灸發(fā)泡方法進(jìn)行評(píng)價(jià),切合臨床,具有評(píng)價(jià)意義。在發(fā)泡液內(nèi)總細(xì)胞數(shù)量的計(jì)算方面,筆者發(fā)現(xiàn)天灸泡液中有大量細(xì)胞募集,總數(shù)量約為5×106/mL,并且發(fā)泡液最大收集的總體積可達(dá)到2 mL,這就對(duì)今后大鼠天灸發(fā)泡液內(nèi)細(xì)胞以及相關(guān)因子的研究提供了可能。

另外,本課題組的另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)天灸敷藥后(4 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h)發(fā)泡區(qū)域皮膚組織病理學(xué)和泡液的觀察,發(fā)現(xiàn)皮膚不僅棘層有不同程度的肥厚和松解,而且基底層細(xì)胞也均有變性或缺失(HE染色,見(jiàn)圖E、F)。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn),筆者發(fā)現(xiàn)在天灸發(fā)泡的過(guò)程中,棘層的松解起到了關(guān)鍵性作用[14-15]。在天灸發(fā)泡液的研究方面,鄒曉軍等[16]研究發(fā)現(xiàn),發(fā)泡液中大部分是中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞(DC),而且發(fā)泡液的DC是外周血DC的3～10倍,斑蝥的發(fā)泡作用可以局部聚集DC并促進(jìn)其成熟和分化,從而達(dá)到免疫調(diào)節(jié)作用。天灸可以調(diào)節(jié)免疫,本課題組也在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)天灸發(fā)泡的性質(zhì)是一種炎性刺激,還兼有疼痛刺激的成分,這兩個(gè)因素相互協(xié)同,相互存在。故筆者認(rèn)為通過(guò)天灸發(fā)泡,炎性刺激和免疫調(diào)節(jié)均發(fā)揮作用,并且這種免疫炎癥反應(yīng)可能主要通過(guò)DC來(lái)實(shí)現(xiàn),但還需要進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

斑蝥酊中發(fā)泡成分以斑蝥素為主,國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)人為對(duì)象可用斑蝥素進(jìn)行皮膚發(fā)泡[17-19],但筆者預(yù)實(shí)驗(yàn)中用斑蝥素代替斑蝥酊,反而在大鼠皮膚沒(méi)有出現(xiàn)發(fā)泡的效果,這可能與人和大鼠皮膚的差異性有關(guān)。故筆者認(rèn)為很可能是以斑蝥素為主的成分刺激了皮膚從而導(dǎo)致發(fā)泡的效果,但并不單純是斑蝥素這單一成分。斑蝥素確有肝腎毒性,經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)后,筆者發(fā)現(xiàn)近年來(lái)斑蝥素肝腎毒性的研究多以小鼠為對(duì)象進(jìn)行,大鼠報(bào)道則較少,主要有腹腔注射、灌胃、膀胱灌注和直接經(jīng)直腸給藥等方式[20-23]。通過(guò)參考其使用劑量,筆者發(fā)現(xiàn),無(wú)論是選擇斑蝥素半數(shù)致死量(LD50,1.86 mg/kg)或斑蝥粉0.05 g/穴刺激,均對(duì)肝臟或腎臟有損傷,如鄒建軍等[20]研究發(fā)現(xiàn)斑蝥素腹腔注射后對(duì)小鼠肝、腎有明顯的毒性作用,其中5 h左右肝損害最嚴(yán)重,3 h左右腎臟損害最嚴(yán)重,并且其毒性隨給藥量增加而增強(qiáng)。劉文吉[23]通過(guò)斑蝥粉0.05 g/穴刺激,觀察天灸對(duì)大鼠肝纖維化的防治效應(yīng),發(fā)現(xiàn)天灸組與正常組相比,其血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平均有不同程度的增高。故筆者認(rèn)為,斑蝥酊天灸發(fā)泡是一種以斑蝥素為主要成分的發(fā)泡刺激,它可以對(duì)大鼠肝腎造成一定的損傷,這考慮是造模本身對(duì)動(dòng)物的不良反應(yīng)。但結(jié)合上述文獻(xiàn)記載,筆者認(rèn)為無(wú)論是參考小鼠或大鼠斑蝥的用量情況,本實(shí)驗(yàn)中選擇5%的斑蝥酊濃度是在安全劑量以內(nèi)。

斑蝥屬于有毒的刺激性藥物,故在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格佩戴口罩和手套,以防止呼吸道和皮膚的損傷[24-25]。在泡液收集的過(guò)程中,筆者還發(fā)現(xiàn)部分泡體出現(xiàn)了面積大但泡液少的情況,這可能和泡體表皮層疏松、泡液向周?chē)鷿B漏有關(guān),故泡液應(yīng)當(dāng)及時(shí)收集,需避免大鼠過(guò)多的劇烈活動(dòng)。最后,本方法也存在一定的不足之處,首先是大鼠發(fā)泡的位置不規(guī)律,尚難集中在中心區(qū)域發(fā)泡,邊緣區(qū)域發(fā)泡亦多見(jiàn);其次,泡體形狀不可人為控制;再次,泡體大小差異性大。這些都需要進(jìn)一步探索。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)成功實(shí)現(xiàn)了SD大鼠的天灸發(fā)泡,在一定程度上復(fù)制了人體天灸的過(guò)程,模擬了臨床應(yīng)用天灸的諸多特征。該模型的建立可以為天灸的實(shí)驗(yàn)研究提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和模型參考[26]。今后本課題組將會(huì)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行繼續(xù)嘗試和改進(jìn),以期實(shí)現(xiàn)大鼠發(fā)泡位置、大小和泡體形狀的人為可控性,并且基于此模型基礎(chǔ)上的動(dòng)物天灸泡液成分以及天灸機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究也將會(huì)是新的方向。

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Establishment and Evaluation of a Rat Model of Formation of Blisters in Vesiculation Moxibustion

-,-,-,-,-.

,310053,

To explore a stable method to establish a rat model of formation of blisters in vesiculation moxibustion.Eight male Sprague-Dawley (SD) rats were anesthetized and depilated. 0.018 g cotton balls were filled in the center of the PU waterproof blank paste plaster.5% cantharides tincture 200mL was drawn to soak the cotton ball evenly and then was applied. Two hours later, 200mL cantharides tincture was added once and then it was sealed. The blister fluid was collected 4 h later. This method was evaluated by observing the formation rate of blisters, the size of blister, the volume of blister fluid, the absorption of blister fluid, the scab in the area of blisters, the mortality rate of rats and the total number of cells in blister fluid.The formation rate of blisters with application of 5% cantharides tincture 200mL was high, the volume of blister fluid and the size of blister were more ideal, and the mortality rate of rats was low.The stable formation of blisters on the skin of rats can be achieved with application of 5% cantharides tincture 200mL. The operation is convenient and the mortality rate of rats is low.

Blistering therapy; Vesiculation moxibustion; Cantharides tincture; Model, Rats; Moxibustion

1005-0957(2019)13-0055-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2019.13.0055

2018-11-03

“十三五”浙江省中醫(yī)藥(中西醫(yī)結(jié)合)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)計(jì)劃(2017-XK-A18)

肖雙凱(1989—),男,2015級(jí)碩士生,Email:379691025@qq.com

林咸明(1966—),男,教授,Email:linxianming66@126.com