任澤文 肖志紅 吳 紅 張愛(ài)華 趙夢(mèng)瑞 彭映輝 黎繼烈

(中南林業(yè)科技大學(xué)生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，長(zhǎng)沙 410004) (湖南省林業(yè)科學(xué)院2，長(zhǎng)沙 410004) (湖南糧食集團(tuán)有限責(zé)任公司3，長(zhǎng)沙 410083) (南開(kāi)大學(xué)化學(xué)院4，天津 300071)

油茶(Camelliaoieifera)，山茶科山茶屬，為常綠小喬木或灌木，是我國(guó)南方主要的一種木本食用油料樹(shù)種[1]。油茶加工后產(chǎn)生了大量的油茶餅粕，未能得到充分的利用[2]。油茶餅粕營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于15%，適合作為微生物發(fā)酵的基質(zhì)[3-5]。油茶餅粕中的茶皂素質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般在15%～25%，還存在少許的單寧、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)成分，導(dǎo)致其在飼料方面的應(yīng)用受到一定的限制[6]。因此，尋求一種高效、安全的降解油茶餅粕中茶皂素的新方法尤為重要。利用微生物降解油茶餅粕中的茶皂素具有安全、高效、環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，因此越來(lái)越受到研究人員的關(guān)注。目前，國(guó)內(nèi)已有部分細(xì)菌和真菌被應(yīng)用于茶皂素的降解研究上，如地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和桔青霉(Penicilliumcitrinum)等菌種，降解率在60%～75%之間[7-11]。本研究旨在篩選到能夠更高效降解茶皂素的菌株，探究其固態(tài)發(fā)酵降解油茶餅粕中茶皂素的條件，為提高油茶餅粕的利用提供參考。

1 材料與方法

1. 1 材料

油茶餅粕：湖南省林業(yè)科學(xué)院提供，105 ℃烘干粉碎后過(guò)40目篩，茶皂素含量為13.8%；

1.1.1 培養(yǎng)基

真菌分離培養(yǎng)基[12]：葡萄糖2%,瓊脂2%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，鏈霉素30μg/mL，pH自然。

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g, 葡萄糖20 g,瓊脂15～20 g,蒸餾水1 000 mL,pH自然。

PDA液體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然(添加20顆小玻璃珠)。

油茶餅粕發(fā)酵培養(yǎng)基：30 g油茶餅粕，24 mL蒸餾水，pH自然。做法：30 g油茶餅粕添加24 mL蒸餾水在不銹鋼盆子里拌勻并覆蓋一層保鮮膜，靜置30 min，使油茶餅粕與水混合均勻后裝進(jìn)組培瓶中，121 ℃滅菌20 min。

1.1.2 試劑與儀器

無(wú)水乙醇、香草醛、濃硫酸、氯化鈉等均為分析純；真菌DNA試劑提取盒；CJ-1D潔凈工作臺(tái)；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)；SPX智能型培養(yǎng)箱；電熱鼓風(fēng)干燥箱；自動(dòng)高壓滅菌鍋；PHS-3C精密酸度計(jì)；V-5100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶皂素含量及其分析方法

茶皂素的提取方法采用微波輔助法[13]，測(cè)量方法采用香草醛-濃硫酸顯色法[14]。

1.2.2 降解茶皂素菌種的篩選

初篩：取自然發(fā)酵的油茶粕，準(zhǔn)確稱取10 g樣品用90 mL無(wú)菌水稀釋并震蕩20 min，梯度稀釋涂布到分離培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d，根據(jù)單菌落大小、表面結(jié)構(gòu)、質(zhì)地、光澤和顏色等特征，挑選形態(tài)特征差異明顯的單菌落進(jìn)行劃線純化，編號(hào)并保存。

復(fù)篩：將實(shí)驗(yàn)所得菌株接種于PDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)1 d后接種至油茶餅粕培養(yǎng)基中，30 ℃固態(tài)靜置發(fā)酵,發(fā)酵72 h后測(cè)量茶皂素的含量，計(jì)算其降解率，并判斷菌株降解茶皂素能力的強(qiáng)弱。

1.2.3 菌株的鑒定

1.2.3.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

按照《真菌鑒定手冊(cè)》[15]和《中國(guó)真菌志》[16]的方法，將L-2菌株的孢子接種于PDA培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)，分別于第 5天和第 10天觀察菌落的顏色、質(zhì)地、表面紋飾和生長(zhǎng)速度等特征。

1.2.3.2 菌種的ITS鑒定

從 PDA培養(yǎng)基上輕輕刮取培養(yǎng)5 d左右的菌落邊緣菌絲體5 mg，將其用液氮研磨成粉末狀。采用真菌DNA提取試劑盒提取供試菌株DNA，引物：ITS1(5′-TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3′)和 ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3′)擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank 中進(jìn)行 BLAST 相似性比對(duì)，最后用MEGA 6.0的Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 種子液的培養(yǎng)

將篩選出的菌種接種至PDA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min，恒溫?fù)u床培養(yǎng)18 h，作為發(fā)酵種子液備用。

1.2.4.2 固態(tài)發(fā)酵的初始條件

將油茶餅粕培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌處理后，接種10%的種子液，發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時(shí)間為72 h。

1.2.4.3 發(fā)酵時(shí)間選擇

在其他條件不變的情況下，設(shè)置發(fā)酵溫度為30 ℃，初始含水量為80%，設(shè)置不同的發(fā)酵時(shí)間分別為12、24、36、48、72、96、120 h，之后檢測(cè)茶皂素的降解率。期間每隔12 h搖瓶翻樣1次，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.4.4 發(fā)酵溫度選擇

在其他條件不變的情況下，選擇最優(yōu)的發(fā)酵時(shí)間，其他條件與處理同1.2.4.3，設(shè)置發(fā)酵溫度為24、26、28、30、32、34、36 ℃。

1.2.4.5 初始含水量選擇

在其他條件不變的情況下，選擇最優(yōu)的發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度，其他條件與處理同1.2.4.3，設(shè)置初始含水量分別為為60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%。

1.2.4.6 初始加酸量選擇

在其他條件不變的情況下，選擇最優(yōu)的發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和初始含水量，其他條件與處理同1.2.4.3，設(shè)置不同的初始加酸量分別為0.01 mol/L的HCl 2、4、6、8、10 mL。

1.2.5 黑曲霉降解油茶餅粕中茶皂素的條件響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Bnhnken響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化分析，設(shè)計(jì)溫度、時(shí)間和初始加酸量3個(gè)因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，以(-1,0,1)編碼，根據(jù)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)后，運(yùn)用Design Expert 軟件對(duì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合后得到二次回歸方程，然后對(duì)各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)進(jìn)行分析，得到最優(yōu)解，優(yōu)化發(fā)酵條件并進(jìn)行驗(yàn)證，最終確定利用黑曲霉降解茶皂素的最優(yōu)的發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的篩選結(jié)果

通過(guò)初篩得到6株目標(biāo)菌種，經(jīng)過(guò)復(fù)篩后得到目的菌株的降解率，目的菌種對(duì)油茶餅粕中的茶皂素的降解率如圖1所示，各菌株的降解率有較大的差異。

圖1 目的菌種對(duì)油茶餅粕中的茶皂素的降解率

本研究中的菌株來(lái)源于自然篩選，對(duì)于油茶餅粕中的茶皂素具有天然的降解優(yōu)勢(shì)，黑曲霉L-2在自然條件下的降解率達(dá)到了60%以上，對(duì)比其他的菌種來(lái)說(shuō)，菌種具有一定的優(yōu)勢(shì)性；固態(tài)發(fā)酵相比于液態(tài)發(fā)酵在降解油茶餅粕中的茶皂素更具有優(yōu)勢(shì)，推測(cè)可能的原因是黑曲霉L-2是絲狀真菌，在固態(tài)發(fā)酵中能夠使油茶餅粕起到蓬松多孔的狀態(tài)，增大了菌種接觸營(yíng)養(yǎng)和氧氣的作用，液態(tài)發(fā)酵對(duì)于不溶于水的油茶餅粕的傳質(zhì)傳氧有一定的限制作用。因此選取降解率最高的L-2作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的菌種。

2.2 苗種的形態(tài)學(xué)和分子鑒定

菌株L-2的平板培養(yǎng)正面形態(tài)圖(左)和平板反面形態(tài)圖(右)如圖2所示。0 ℃恒溫培養(yǎng)L-2,培養(yǎng)初期，培養(yǎng)基表面長(zhǎng)出質(zhì)地疏松的較干燥的白色菌落，外觀形如絲狀小絨毛，與培養(yǎng)基的結(jié)合比較緊密。5 d后，表面開(kāi)始出現(xiàn)黑色孢子，均勻分布在菌落中間成熟部分。菌株L-2 rDNA-ITS序列同源性系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3所示，菌株L-2的rDNA-ITS序列與黑曲霉AspergillusnigerHQ305563.1相似性達(dá)到了99%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征鑒定為黑曲霉Aspergillusniger。

圖2 菌株L-2的平板培養(yǎng)正面形態(tài)圖(左)和平板反面形態(tài)圖(右)

圖3 菌株L-2 rDNA-ITS序列同源性系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌種降解茶皂素的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌種降解茶皂素的影響如圖4所示。發(fā)酵前期，隨著時(shí)間的推移，降解率在逐步提高；96 h后，茶皂素的降解率趨于穩(wěn)定，達(dá)到88.33%。在油茶餅粕發(fā)酵初期，由于黑曲霉可以產(chǎn)生一些活性酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及纖維素酶等，可以利用其產(chǎn)生的酶對(duì)油茶餅粕中大分子的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行降解，有助于黑曲霉L-2的生長(zhǎng)。發(fā)酵中期由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，茶皂素作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供菌體生長(zhǎng)的需要，因此發(fā)酵中期茶皂素的降解率在不斷的上升。發(fā)酵后期，油茶餅粕中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由于大量消耗，不足以為黑曲霉L-2的生長(zhǎng)提供保障，茶皂素的降解率也趨于穩(wěn)定的狀態(tài)。

圖4 發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、初始含水量以及初始加酸量對(duì)于茶皂素降解率的影響

2.3.2 發(fā)酵溫度對(duì)菌種降解茶皂素的影響

發(fā)酵溫度對(duì)菌種降解茶皂素的影響如圖4所示，隨著溫度的升高，茶皂素的降解率一直在升高，在32 ℃時(shí)，茶皂素的降解率達(dá)到了最大值86.12%。溫度高于32 ℃后，茶皂素的降解率下降的趨勢(shì)很明顯。溫度對(duì)于菌株降解茶皂素的影響比較顯著，因此選擇最佳的降皂溫度為32 ℃。

2.3.3 初始含水量對(duì)菌種降解茶皂素的影響

初始含水量對(duì)菌種降解茶皂素的影響如圖4所示，隨著含水量的不斷增加，茶皂素的降解率在不斷的升高，在含水量在80%的時(shí)候達(dá)到最大88.15%。在含水量超過(guò)80%以后，茶皂素的降解率持續(xù)降低。固態(tài)發(fā)酵中，氧傳遞對(duì)于菌體的生長(zhǎng)有至關(guān)重要的作用。含水量在80%以下，油茶餅粕培養(yǎng)基呈現(xiàn)一種疏松、多孔的狀態(tài)，這對(duì)于氧氣的傳遞有一定的促進(jìn)作用；而隨著含水量的升高，固體培養(yǎng)基越來(lái)呈現(xiàn)一種緊密的狀態(tài)，影響氧的傳遞。含水量太低也會(huì)導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)缺水分而不能大量的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響茶皂素的降解。因此選擇80%的含水量作為最適含水量。

2.3.4 初始加酸量對(duì)菌種降解茶皂素的影響

初始加酸量對(duì)菌種降解茶皂素的影響如圖4所示，隨著加酸量的不斷增加，茶皂素的降解率在不斷的升高，在加酸量在4 mL的時(shí)候達(dá)到最大89.31%。在加酸量超過(guò)4 mL以后，茶皂素的降解率持續(xù)降低。霉菌的最適生長(zhǎng)環(huán)境為酸性條件，因此，添加一定的酸可以促進(jìn)黑曲霉的生長(zhǎng)，同時(shí)可以抑制其他有害微生物的生長(zhǎng)，提高了茶皂素的降解率。初始加酸量超過(guò)4 mL以后，降解率隨著酸的量的增加而降低，推測(cè)降解茶皂素的酶最適pH在加酸量4 mL附近，此時(shí)的pH=4.58。

2.3.5 響應(yīng)面分析方案和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

單因素實(shí)驗(yàn)分別從發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、初始加酸量和含水量分析了不同的因素對(duì)于黑曲霉L-2降解油茶餅粕中的茶皂素的影響，為了更加準(zhǔn)確簡(jiǎn)便地分析不同因素對(duì)降解茶皂素的交互影響，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析，選取對(duì)結(jié)果影響較大的3個(gè)因素發(fā)酵溫度(A)發(fā)酵時(shí)間(B)初始加酸量(C)進(jìn)行Box-Bnhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以茶皂素的降解率(Y)為響應(yīng)值在全局范圍內(nèi)進(jìn)行尋優(yōu)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果，Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平表見(jiàn)表1和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平表

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

回歸模型方差分析見(jiàn)表3。應(yīng)用Design-Expert 10.0.8軟件對(duì)表2和表3中的結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，得到降解茶皂素的二次回歸方程模型。由表3可知，從各個(gè)因素的顯著性水平差異可知，對(duì)茶皂素的降解率的影響次序?yàn)锽>A>C；二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)茶皂素的降解率的影響都達(dá)到了極顯著水平(P<0.001)。模型P<0.000 1，表明回歸模型極顯著，其校正決定系數(shù)AdjR2=98.46%表明僅有總變異的1.54%不能由該模型進(jìn)行解釋。相關(guān)系數(shù)R2=99.33%，表明該模型擬合程度較好，實(shí)驗(yàn)誤差較小，失擬項(xiàng)不顯著，回歸方程可以較好地描繪各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。

表3 回歸模型方差分析

注：**為極顯著(P<0.01)，*為顯著(P<0.05)，R2=99.33%,AdjR2=98.46%。

所得的二次多項(xiàng)回歸擬合方程為：

茶皂素降解率=93.44-1.66A+2.678B+0.39C-1.69AB-0.63AC+1.32BC-6.45A2-5.07B2-3.09C2

根據(jù)方程得到的模型極值點(diǎn)取值為A=-0.177B=-0.313C=0.147，此時(shí)響應(yīng)值Y的取值為最大值94.036%，即發(fā)酵溫度31.293 ℃，發(fā)酵時(shí)間103.507 h，初始加酸量4.574 mL，為方便操作，發(fā)酵時(shí)間取31.3 ℃，發(fā)酵時(shí)間取103.5 h，初始加酸量為4.57 mL。

2.3.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用正交實(shí)驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行培養(yǎng)基的配制，用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的結(jié)果作為發(fā)酵條件，重復(fù)3組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行茶皂素的降皂實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得降解率為93.96%，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明回歸模型真實(shí)可靠。

3 結(jié)論

單因素和響應(yīng)面的分析結(jié)果表明：發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、初始加酸量3個(gè)主要因素對(duì)黑曲霉L-2降解油茶餅粕中茶皂素有顯著的影響，影響的大小為：發(fā)酵時(shí)間>發(fā)酵溫度>初始加酸量。黑曲霉降解油茶餅粕中茶皂素的最佳條件為發(fā)酵時(shí)間取31.3 ℃，發(fā)酵時(shí)間取103.5 h，初始加酸量為4.57 mL，此條件下可使黑曲霉L-2對(duì)于油茶餅粕種的茶皂素有最佳的降解率，達(dá)到93.96%。