米 智， 劉荔貞， 李 慧， 張弘弛

(山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1，大同 037009)(山西大同大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院2，大同 037009)

胡麻是亞麻的俗稱，屬亞麻科(Linaceae)亞麻屬(Linum)普通亞麻種群(LinumusitatissmumL.)，一年生或多年生，自花授粉二倍體草本植物[1]，廣泛用于油脂、紡織、印刷、制革、醫(yī)藥、食品等行業(yè)，具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。胡麻籽的營(yíng)養(yǎng)成分主要是油脂(30%～40%)和蛋白質(zhì)(約20%)，以及一定量的礦物質(zhì)、木酚素、亞麻籽膠、維生素和有毒因子或抗?fàn)I養(yǎng)因子生氰糖苷、抗VB6因子、植酸等。胡麻籽的各種成分決定了其具有各種各樣的生理功能，如抗炎[2,3]、降血脂和降膽固醇[4]、增強(qiáng)胰島素功能及防治糖尿病[5]、腎損傷保護(hù)與輔助治療[6]、降低慢性疾病如肥胖風(fēng)險(xiǎn)[7,8]、以及抑制癌癥的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)移[9]等。

亞麻籽粕是亞麻籽經(jīng)過除雜、預(yù)處理、脫皮、翻炒(75～80 ℃，60 min)、壓榨、溶劑浸提(50～60 ℃，90 min)、脫溶/烘干、干燥/冷卻獲得，而亞麻籽餅是只經(jīng)過壓榨不經(jīng)浸提[10]，很多文獻(xiàn)中指亞麻經(jīng)過溶劑浸提或機(jī)械壓榨取油后的殘余物經(jīng)粉碎或壓片處理后即為亞麻籽餅粕。

胡麻籽餅粕營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量豐富[11]，如粗蛋白[12]、脂肪、無氮浸出物、纖維素[13]等可作為牲畜的飼料，也是加工配合飼料的重要原料。胡麻籽餅粕含有氮、磷、鉀三種營(yíng)養(yǎng)成分，經(jīng)過漚制發(fā)酵，是農(nóng)作物的優(yōu)質(zhì)有機(jī)肥料，但因其含有抗?fàn)I養(yǎng)因子和有毒成分而大部分被丟棄，造成資源浪費(fèi)。胡麻籽餅粕進(jìn)行酶解可獲得多種生物活性的肽，具有抗氧化、抗病毒、抗高血壓、激素調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)等作用[14]。含有活性成分α-亞麻酸[14]、脂肪酸[15]、木酚素[16]、亞麻籽膠[17]、黃酮[18]等。亞麻籽餅粕不僅能夠?yàn)槿撕蛣?dòng)物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還具有抗炎、抗癌、調(diào)節(jié)血脂等多種有益作用[19]。

目前，胡麻籽餅粕中的蛋白提取工藝及功能報(bào)道較多，而對(duì)其黃酮提取工藝及抗氧化性研究報(bào)道較少；同時(shí)基于索氏提取工藝的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合乙醇有機(jī)溶劑無毒、沸點(diǎn)低、回收方便等特點(diǎn)、適于索氏提取法進(jìn)行胡麻籽餅粕中黃酮的提取，有利于降低生產(chǎn)成本，提高效率等[20]。

本實(shí)驗(yàn)以壓榨取油后的胡麻籽餅粕為研究對(duì)象，通過單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面分析的方法，優(yōu)化索氏提取法提取胡麻籽餅粕黃酮的最佳工藝條件，并采用清除DPPH、ABTS自由基的方法測(cè)定其抗氧化活性，以期為胡麻籽餅粕黃酮的提取及其高值化綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡麻籽餅粕；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、2，2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)和維生素C(VC)、K2S2O8、C2H5OH、Al(NO3)3、NaNO2、NaOH：均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TLSE-02型索氏提取器，BSA323S精密電子天平，臺(tái)式DHG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，SXKW-1 000 mL數(shù)顯控溫電熱套，800Y萬能粉碎機(jī)，JC-UT2000型紫外/可見分光光度計(jì)，QYRE-2A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，JC-16GT高速冷凍離心機(jī)等。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加少許無水乙醇，在超聲波輔助下，搖勻使之充分溶解并定容至50 mL，得0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液[21]，參照米智等[20]方法制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 胡麻籽餅粕黃酮提取工藝流程

胡麻籽餅粕處理：胡麻經(jīng)過100～110 ℃翻炒10 min后，經(jīng)過機(jī)械壓榨取油后即為胡麻籽餅粕。石油醚將其脫脂后，50～55 ℃烘干，粉碎過60目篩，干燥保存待用。

黃酮提取工藝流程：處理后的胡麻籽餅粕→稱重→分/包裝→浸提→定容→測(cè)定→計(jì)算。

1.3.3 胡麻籽餅粕黃酮的測(cè)定方法

精確量取1 mL浸提液做為待測(cè)液，同1.3.1，做3組平行實(shí)驗(yàn)求平均值，代入線性回歸方程，得到胡麻籽餅粕黃酮的含量。

胡麻籽餅粕黃酮提取量(mg/100 g)=

式中：C為胡麻籽餅粕黃酮質(zhì)量濃度mg/mL；N為稀釋的倍數(shù)；V為提取液總體積/mL；W為樣品的質(zhì)量/g。

1.3.4 胡麻籽餅粕黃酮提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 提取時(shí)間

準(zhǔn)確稱取處理后胡麻籽餅粕粉末2 g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比(g∶mL)為1∶25，設(shè)置提取時(shí)間為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h提取胡麻籽餅粕中總黃酮，測(cè)定提取液吸光值并計(jì)算黃酮提取量。

1.3.4.2 乙醇濃度

準(zhǔn)確稱取處理后胡麻籽餅粕粉末2 g，在料液比(g∶mL)為1∶25、提取時(shí)間為2 h，設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%提取胡麻籽餅粕中總黃酮，測(cè)定提取液吸光值并計(jì)算黃酮提取量。

1.3.4.3 料液比

準(zhǔn)確稱取處理后胡麻籽餅粕粉末2 g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、提取時(shí)間為2 h，設(shè)置料液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35(g∶mL)提取胡麻籽餅粕中總黃酮，測(cè)定提取液吸光值并計(jì)算黃酮提取量。

1.3.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

根據(jù)胡麻籽餅粕黃酮提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從提取時(shí)間(A)、乙醇濃度(B)和料液比(C)3個(gè)因素中，分別選取3個(gè)對(duì)胡麻籽餅粕黃酮提取量影響較大的水平，以黃酮提取量為考察目標(biāo)，運(yùn)用Design-Expert V8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，確定相應(yīng)面試驗(yàn)方案，并建立回歸方程預(yù)測(cè)模型確定最佳提取工藝參數(shù)。

1.3.6 胡麻籽餅粕黃酮提取工藝的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

為了更好的驗(yàn)證索氏提取法提取胡麻籽餅粕黃酮的可靠性和合理性，在響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了3次平行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.3.7 胡麻籽餅粕黃酮抗氧化性測(cè)定

1.3.7.1 胡麻籽餅粕黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)最優(yōu)條件下提取胡麻籽餅粕黃酮提取液，進(jìn)行適當(dāng)濃縮，用無水乙醇配制成0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.2 mg/mL的樣品溶液，分別精確量取以上溶液0.6 mL，加入0.4 mmol/L DPPH溶液2.4 mL，混勻，在黑暗中室溫下反應(yīng)40 min后，在517 nm處測(cè)定吸光值[22,23]。用VC為本實(shí)驗(yàn)的參照物，以半數(shù)清除率IC50值作為抗氧化活性評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照公式計(jì)算清除率。

DPPH自由基清除率=(A對(duì)照-A樣品+A空白)/A對(duì)照×100%

式中：A對(duì)照為0.6 mL無水乙醇+2.4 mL DPPH溶液；A樣本為0.6 mL胡麻籽餅粕黃酮待測(cè)液+2.4 mL DPPH溶液；A空白為0.6 mL胡麻籽餅粕黃酮待測(cè)液+2.4 mL無水乙醇。

1.3.7.2 胡麻籽餅粕黃酮對(duì)ABTS自由基清除能力測(cè)定

量取7 mmol/L的 ABTS溶液與2.45 mmol/L的K2S2O8溶液等體積混勻，室溫且避光條件下反應(yīng)12～16 h，形成ABTS自由基離子(ABTS+·)儲(chǔ)備液。測(cè)試前，將ABTS+·儲(chǔ)備液用無水乙醇稀釋至在734 nm波長(zhǎng)下的吸光值為0.70±0.02，作為ABTS+·工作液保存于30 ℃待用。取胡麻籽餅粕黃酮濃縮液，用無水乙醇配制成0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.2 mg/mL的樣品溶液，分別精確量取以上溶液1 mL，加入ABTS+·工作液6 mL，混勻，在黑暗中30 ℃下反應(yīng)30 min后，在734 nm處測(cè)定吸光值[24,25]。以VC作為本實(shí)驗(yàn)的參照物，以半數(shù)清除率IC50值作為抗氧化活性評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照公式計(jì)算清除率。

ABTS自由基清除率=(A對(duì)照-A樣品+A空白)/A對(duì)照×100%

式中：A對(duì)照為1 mL去離子水+6 mL ABTS工作液；A樣本為1 mL胡麻籽餅粕黃酮待測(cè)液+6 mL ABTS工作液；A空白為1 mL胡麻籽餅粕黃酮待測(cè)液+6 mL去離子水。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以不同濃度蘆丁(C，mg/mL)為橫坐標(biāo)，OD510吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程為：y=9.25 6x-0.312，R2=0.992。

2.2 胡麻籽餅粕黃酮提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，胡麻籽餅粕黃酮提取量逐漸升高，并在2.5 h時(shí)黃酮含量達(dá)到了最高值，約為20.1 mg/100 g，當(dāng)提取時(shí)間再延長(zhǎng)，黃酮提取量略有下降。在做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)時(shí)，選取提取時(shí)間為2.0、2.5、3.0 h作為3個(gè)水平。

胡麻籽餅粕黃酮提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而增加，并在60%時(shí)黃酮提取量達(dá)到最大值，約為21.6 mg/100 g，當(dāng)乙醇濃度再升高時(shí)，胡麻籽餅粕黃酮量反而有所降低。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70% 3個(gè)水平。

胡麻籽餅粕黃酮的提取量隨著料液比的增大而增加，并在1∶25時(shí)達(dá)到最大值，約為21.8 mg/100 g，當(dāng)料液比再增大時(shí)，胡麻籽餅粕黃酮提取量反而降低。在做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)時(shí)，選取料液比為1∶20、1∶25、1∶30三個(gè)水平。

2.3 回歸模型的建立及其分析

響應(yīng)面分析因素與水平見表1。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

建立胡麻籽餅粕黃酮提取工藝參數(shù)的回歸模型，獲得本實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)(胡麻籽餅粕黃酮提取量)的響應(yīng)值(Y/mg/100 g)對(duì)自變量A(提取時(shí)間)、B(乙醇濃度)和C(料液比)的二次多項(xiàng)式回歸方程：胡麻籽餅粕黃酮提取量(Y/mg/100 g)=-80.175+16.55A+1.617 5B+2.66C+0.135AB-0.09AC+5.5E-3BC-4.35A2-0.0173 75B2-0.055 5C2。

回歸模型方差分析見表3。以胡麻籽餅粕黃酮提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)該模型進(jìn)行方差分析及模型系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(表3)?；貧w模型在統(tǒng)計(jì)學(xué)上呈極顯著(P<0.01)，說明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且通過P值可知模型中變量A、AB、A2、B2和C2對(duì)黃酮提取量影響極顯著(P<0.01)，BC項(xiàng)對(duì)黃酮提取量影響顯著(P<0.05)，說明實(shí)驗(yàn)因素與響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，一次項(xiàng)、二次項(xiàng)、AB和BC的交互作

表3 回歸模型方差分析

通過三維響應(yīng)面圖和二維等高線圖分析顯示，隨著提取時(shí)間、乙醇濃度和料液比的增大或延長(zhǎng)，胡麻籽餅粕黃酮的提取量也隨之增大，但當(dāng)提取時(shí)間、乙醇濃度和料液比增大或延長(zhǎng)到一定程度后，黃酮提取量有下降的趨勢(shì)。提取時(shí)間和乙醇濃度的交互作用對(duì)模型影響極顯著，乙醇濃度和料液比的交互作用對(duì)模型影響顯著，從等高線圖中可見其橢圓程度和疏密程度，與模型回歸中的方差分析一致。

2.4 最佳提取條件的確定

由響應(yīng)面軟件分析可得索氏提取胡麻籽餅粕黃酮的最佳工藝：提取時(shí)間為2.58 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60.52%、料液比為1∶24.86，最高提取量為23.23 mg/100 g?？紤]實(shí)驗(yàn)操作的簡(jiǎn)便性，修正提取工藝條件提取時(shí)間為2.5 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%和料液比為1∶25。

2.5 優(yōu)化條件的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出胡麻籽餅粕黃酮提取最佳工藝，進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)測(cè)定胡麻籽餅粕黃酮提取量見表4。3組平行樣數(shù)據(jù)的RSD為0.95%，滿足要求，得出該提取工藝下胡麻籽餅粕黃酮提取量較為穩(wěn)定。

表4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)測(cè)定胡麻籽餅粕黃酮提取量

2.6 胡麻籽餅粕黃酮抗氧化性測(cè)定

2.6.1 胡麻籽餅粕黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定

由圖2可知，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，VC和胡麻籽餅粕黃酮清除DPPH自由基的能力逐漸增大，與濃度成一定的量效關(guān)系。在0.1 mg/mL處，胡麻籽餅粕黃酮清除率為76.94%，該濃度下VC的清除率為96.63%。胡麻籽餅粕黃酮和VC對(duì)DPPH自由基清除率的IC50值分別為0.057和0.024 mg/mL，說明胡麻籽餅粕黃酮具有一定清除DPPH自由基的能力。

圖2 胡麻籽餅粕黃酮和VC對(duì)DPPH自由基的清除率

2.6.2 胡麻籽餅粕黃酮對(duì)ABTS自由基清除能力測(cè)定

由圖3可知，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，胡麻籽餅粕黃酮對(duì)ABTS自由基清除能力逐漸加強(qiáng)，且與VC變化趨勢(shì)較一致。在0.1 mg/mL時(shí)，胡麻籽餅粕黃酮清除率達(dá)到76.89%，該濃度下VC清除率為91.58%。胡麻籽餅粕黃酮和VC對(duì)ABTS自由基清除率的IC50值分別為0.059、0.034 mg/mL，說明胡麻籽餅粕黃酮具有一定清除DPPH自由基的能力。

圖3 胡麻籽餅粕黃酮和VC對(duì)ABTS自由基的清除率

3 結(jié)論

本研究采用索氏提取法，采用單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化胡麻籽餅粕黃酮提取工藝，在提取時(shí)間為2.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比為1∶25時(shí)，胡麻籽餅粕黃酮提取量最大，約為21.9 7 mg/100 g。通過方差分析可知，提取時(shí)間、提取時(shí)間與乙醇濃度交互項(xiàng)對(duì)胡麻籽餅粕黃酮提取量影響均極顯著(P<0.01)，乙醇濃度和料液比交互項(xiàng)對(duì)胡麻籽餅粕黃酮提取量影響顯著(P<0.05)。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可得，該工藝下胡麻籽餅粕黃酮提取量最高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小(RSD)，約為0.95%。通過抗氧化性測(cè)定可得，胡麻籽餅粕黃酮和VC對(duì)DPPH自由基清除率的IC值分別為0.057、0.024 mg/mL；對(duì)ABTS自由基清除率的IC值分別為0.059、0.034 mg/mL，盡管胡麻籽餅粕黃酮對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除率稍弱于VC，但是對(duì)其均有一定的清除能力。