馬桂娟，朱 捷，湯麗華，謝 芳，王紫昕，朱燕燕

(寧夏回族自治區(qū)食品檢測中心，寧夏銀川 750001)

枸杞是藥食同源的功能性特色植物資源，富含類胡蘿卜素、黃酮類和枸杞多糖等生物活性物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于保健食品行業(yè)[1-3]。超臨界 CO2流體萃取的枸杞籽油，也富含類胡蘿卜素、不飽和脂肪酸等成分，從其功能成分上分析，屬于具有保健作用的油脂。目前的藥理研究證實，枸杞子具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力的作用[4]，其活性成分如枸杞多糖、類胡蘿卜素物質(zhì)均有抗氧化作用。

葉黃素、β-胡蘿卜素和玉米黃質(zhì)是類胡蘿卜素物質(zhì)中最重要的物質(zhì)之一，廣泛分布于人體多個組織，對維持健康起到重要作用。玉米黃質(zhì)和葉黃素具有預(yù)防光損傷和防治老年性黃斑衰退癥的功能。β-胡蘿卜素是一種重要的維生素 A 來源，通過攝入 β-胡蘿卜素可以有效地對維生素 A進(jìn)行補(bǔ)充[5]。因此準(zhǔn)確測定枸杞干果和枸杞籽油中玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素和葉黃素的含量，對于正確評價枸杞的營養(yǎng)價值和枸杞籽油功能性成分，開展?fàn)I養(yǎng)學(xué)研究十分必要。高效液相色譜法是測定多種類胡蘿卜素的方法，在不同的樣品中已有相關(guān)研究報道[6-8]。但對枸杞干果及枸杞籽油中玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素和葉黃素檢驗方法鮮見報道。筆者建立能同時測定枸杞干果及枸杞籽油中3種功能性成分的方法，能夠為枸杞干果及枸杞籽油的質(zhì)量控制和質(zhì)量監(jiān)督提供適用的技術(shù)依據(jù)，也為保障枸杞深加工產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試材枸杞購于寧夏中寧，枸杞籽油由枸杞籽經(jīng)超臨界 CO2流體萃取制得，樣品于干燥避光處保存。玉米黃質(zhì)(純度≥95%)，美國ChromaDex公司；β-胡蘿卜素(純度≥97%)，德國Dr.Ehrenstorfer公司；葉黃素(純度≥95%)，北京曼哈格生物科技有限公司；環(huán)己烷(色譜純)、甲基叔丁基醚(色譜純)、正己烷(色譜純)、二氯甲烷(色譜純)，賽默飛世爾科技有限公司；乙醚(色譜純)、無水乙醇(色譜純)，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；二丁基羥基甲苯(BHT，優(yōu)級純)、氫氧化鉀(優(yōu)級純)、無水硫酸鈉(優(yōu)級純)、抗壞血酸(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所有用水均為超純水。

1.2儀器Aglient 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；IKA KS 4000i恒溫振蕩器，德國IKA公司；BUCHI V-850旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士步琦實驗室公司；BS 224 S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器公司；均質(zhì)器，德國IKA公司；UV-2700紫外可見分光光度計，日本島津公司。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別準(zhǔn)確稱取適量玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品，用二氯甲烷配制成500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液(標(biāo)準(zhǔn)儲備液使用前需校正)；分別移取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，用0.1% BHT乙醇溶液稀釋成100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液；準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液適量，用0.1% BHT乙醇溶液提取液稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定由于標(biāo)準(zhǔn)品的來源、工藝的差異，加上標(biāo)準(zhǔn)品在存儲過程中受到溫度、氧化等因素的影響，在每次測定前都應(yīng)對標(biāo)準(zhǔn)儲備液進(jìn)行濃度標(biāo)定。同時不同來源的標(biāo)準(zhǔn)品在不同試劑中有不同的比吸光系數(shù)，標(biāo)定時應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書選擇各自的比吸光系數(shù)[9]。

玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素及葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備液在配制后，在使用前需要對其濃度進(jìn)行校正，具體操作如下：取玉米黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲備液(濃度約為500 μg/mL)20 μL，用10.0 mL甲醇稀釋，混勻；采用1 cm比色杯，以甲醇為空白參比，測定其吸光度。取β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲備液(濃度約為500 μg/mL)20 μL，用10.0 mL正己烷稀釋，混勻；采用1 cm比色杯，以正己烷為空白參比，測定其吸光度。取葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備液(濃度約為500 μg/mL)20 μL，用10.0 mL無水乙醇稀釋，混勻；采用1 cm比色杯，以無水乙醇為空白參比，測定其吸光度。試液中玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素及葉黃素的濃度按公式計算：X=(A×10.02)/(E×0.02)，式中，X為標(biāo)準(zhǔn)儲備液的濃度，A為標(biāo)準(zhǔn)儲備液的吸光度。

表1 測定波長及比吸光系數(shù)

1.5樣品前處理

1.5.1試樣制備。稱取200 g枸杞樣品加入400 g水，用均質(zhì)器打漿后備用，枸杞籽油樣品用前振搖或攪拌混勻。

1.5.2試樣皂化。枸杞樣品稱取2 g(精確至0.1 mg)，置于100 mL 具塞離心管中，加入1 g抗壞血酸、0.2 g BHT和30 mL無水乙醇，于(70±1)℃恒溫振蕩30 min，再加入10 mL氫氧化鉀溶液，邊加邊振搖，蓋上瓶塞。置于已預(yù)熱至(54±2)℃恒溫振蕩箱中，皂化45 min。皂化后立即用冷水冷卻至室溫。

枸杞籽油試樣：準(zhǔn)確稱取2 g(精確至0.1 mg)，置于250 mL錐形瓶中，加入1 g抗壞血酸、0.2 g BHT和 30 mL無水乙醇。加入30 mL氫氧化鉀溶液，邊加邊振搖，蓋上瓶塞，置于已預(yù)熱至(54±2)℃恒溫振蕩箱中，皂化45 min。皂化后立即用冷水冷卻至室溫。

1.5.3試樣萃取。將皂化液轉(zhuǎn)入250 mL分液漏斗中，加入60 mL萃取溶劑(1 g BHT，以200 mL環(huán)己烷溶解，加入400 mL乙醚和400 mL正己烷)，輕輕搖動，排氣，蓋好瓶塞，室溫下振蕩10 min后靜置分層，將水相轉(zhuǎn)入另一分液漏斗中按上述方法進(jìn)行第2次提取。合并有機(jī)相，用50 mL水洗有機(jī)相5～6次，直至水洗近中性。棄水相，有機(jī)相通過無水硫酸鈉過濾脫水。濾液收入250 mL蒸發(fā)瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上(40±2)℃減壓濃縮至近干(不能蒸干)。用0.1% BHT乙醇溶液，充分溶解提取物并定容至10 mL。經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后供液相色譜儀分析。

1.6液相色譜條件色譜柱為C30色譜柱，250 mm×4.6 mm(內(nèi)徑)，粒徑5 μm；進(jìn)樣量50 μL；柱溫30.0 ℃；流速1.0 mL/min；檢測波長445 nm。流動相A為甲醇∶水(88∶12，V/V，含0.1% BHT)，B為甲基叔丁基醚(含0.1% BHT)。梯度洗脫條件見表2。

表2 流動相梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1檢測波長的選擇通過對10 μg/mL的葉黃素、玉米黃質(zhì)及β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行200～600 nm的光譜掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葉黃素在445 nm有最大吸收(圖1a)；玉米黃質(zhì)在450 nm有最大吸收(圖1b)；β-胡蘿卜素在450 nm有最大吸收(圖1c)。因此，該方法選擇445 nm為檢測波長。

圖1 葉黃素(a)、玉米黃質(zhì)(b)、β-胡蘿卜素(c)對照品全波長掃描曲線Fig.1 Spectrophotomentry chromatogram of standard of lutein(a)，zeaxanthin(b)and β-carotene(c)

2.2流動相的確定根據(jù)玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素及葉黃素的化學(xué)性質(zhì)，參考GB5009.248—2016《食品中葉黃素的測定》[10]中色譜條件，該研究采用YMC C30(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，以含0.1%BHT甲醇-水(88∶12)作為A相，含0.1%BHT甲基叔丁基醚作為B相，分離枸杞及枸杞籽油中3種類胡蘿卜素物質(zhì)，葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-胡蘿卜素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖2。

注：1.葉黃素；2.玉米黃質(zhì)；3.β-胡蘿卜素Note：1.Lutein；2.Zeaxanthin；3.β-carotene圖2 葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-胡蘿卜素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 Chromatograms for zeaxanthin，β-carotene and lutein

2.3提取方式的確定枸杞子含有大量多糖成分，粉碎易結(jié)塊，枸杞復(fù)水勻漿處理，可使枸杞中部分糖分溶解。同時對于枸杞植物細(xì)胞壁較厚的樣品，在試樣中先加入乙醇于60～80 ℃回流后再提取，可提高提取效果[9]。因此該研究將枸杞樣品于70 ℃乙醇溶液中回流之后再皂化。

皂化是類胡蘿卜素前處理的一個重要的環(huán)節(jié)。對于枸杞籽油脂肪成分過高的油脂樣品，可采用皂化方式提純凈化；此外枸杞中大部分類胡蘿卜素以酯化形式存在[11-12]，皂化可使枸杞類胡蘿卜素酯成為游離態(tài)的類胡蘿卜素，這樣可以簡化色譜的分離。但由于類胡蘿卜素對光、熱、氧不穩(wěn)定，在提取過程可通入氮氣，加入抗壞血酸和BHT等抗氧化劑起到保護(hù)作用。

采用乙醚、乙醚-石油醚、乙醚-正己烷-環(huán)己烷為提取溶劑進(jìn)行液液萃取對比試驗，其中用乙醚、乙醚-石油醚為提取溶劑時，葉黃素的回收率僅為20%～30%，而用乙醚-正己烷-環(huán)己烷為提取溶劑，3種物質(zhì)的提取效果回收率最高。因此將乙醚-正己烷-環(huán)己烷作為提取試劑。

2.4線性范圍和檢測限在選定的儀器條件下進(jìn)行色譜分析，每個濃度點重復(fù)測定 3 次，測得峰面積平均值對濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從表3可看出，玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素及葉黃素在其相應(yīng)的線性范圍表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

表3 3種類胡蘿卜素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限

2.5回收率與精密度精密稱取枸杞籽油、枸杞樣品各6份，每份樣品中分別加入3種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按“1.5”操作方法進(jìn)行處理，并與標(biāo)準(zhǔn)溶液同時進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表4)，回收率為70%～120%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于 10%，可以滿足日常監(jiān)測中3種類胡蘿卜素分析的準(zhǔn)確度與精密度要求。

表4 枸杞和枸杞籽油中3種類胡蘿卜素的回收率和精密度試驗(n=6)

3 結(jié)論

該研究建立了高效液相色譜法同時測定枸杞干果及枸杞籽油中玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素和葉黃素的檢驗方法。該方法前處理操作簡單、皂化時間短、凈化效果好，能夠滿足枸杞干果及枸杞籽油中3種類胡蘿卜素的定性和定量分析，可用于實際樣品的分析。