劉元，錢軍*，郭晨旭，朱超，劉先富，承澤農

（1.安徽省蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科，安徽 蚌埠 233000；2.病理科）

從2015年的中國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，胃癌在惡性腫瘤中的發(fā)病率、患者的死亡率仍居于癌癥的前列［1］，其治療主要是手術與化療的結合，預后不理想。近些年，在基礎研究中發(fā)現(xiàn)，很多腫瘤細胞中含有一種具有腫瘤干細胞特性的細胞亞群，即側群（side population，SP）細胞，其具有高分化、自我復制及在體內高成瘤等特性［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)，SP細胞在腫瘤細胞的耐藥、復發(fā)方面起著重要的作用，從而導致腫瘤的治療效果不理想［4-5］。青蒿素是屠呦呦于1971年從黃花蒿中提取，并且對鼠瘧原蟲的控制效果較好［6］，屠呦呦也因此獲得2015年諾貝爾獎。近年來，隨著對青蒿素的研究，發(fā)現(xiàn)青蒿素具有較強的抗腫瘤活性［7-8］。目前就青蒿素對胃癌SGC-7901 SP細胞裸鼠移植瘤生長的影響報道較少，本實驗擬探究SP細胞的高致瘤性及青蒿素對各組移植瘤生長及凋亡蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級BALB∕c-nu裸鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，4周齡，體重（16.6±0.92）g，實驗動物許可證號：SCXK（京）2012-0001，均為雌性。

1.2 實驗試劑及藥材 RPMI-1640不完全培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液（PBS）、青蒿素購于杭州四季青公司，Hocehst 33342染料購于美國Sigma公司，維拉帕米購于上海醫(yī)藥集團有限公司，免疫組化試劑盒購自英國Abcam公司，SGC-7901胃癌細胞株購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。1.3 細胞培養(yǎng) 將胃癌SGC-7901細胞培養(yǎng)在37℃、5%CO2、95%濕度恒溫箱中。定期換液、傳代。

1.4 胃癌SGC-7901細胞株SP細胞及NSP細胞的分選 取處于對數(shù)生長期的細胞，消化、離心后棄上清液，用含2%胎牛血清（FBS）的PBS將細胞數(shù)調整為1×106∕ml。取其中2只離心管作為拮抗組，細胞懸液中加入維拉帕米 10 μl∕ml，余下的離心管作為實驗組，在每個離心管的細胞懸液中加入 Hoechst 33342 5 μl∕ml，移入培養(yǎng)箱中孵育90 min，15 min振蕩一次。孵育后離心5 min，棄上清液，用含2%FBS的PBS將細胞數(shù)重懸至1×106∕ml。移至滅菌流式管中，流式細胞儀檢測分選，Hoechst 33342在350 nm條件被激發(fā)，獲得熒光呈雙重波長：藍光402～446 nm；紅光650～670 nm，分別收集SP細胞及NSP細胞。

1.5 裸鼠接種細胞懸液的制備 取對數(shù)生長期的SP細胞和NSP細胞，消化、離心后棄上清液；用PBS重懸細胞，血球計數(shù)板記數(shù)活細胞，當活細胞比率＞95%，稀釋細胞濃度至5×106∕ml。

1.6 實驗分組 取裸鼠20只，隨機分為SP細胞組和NSP細胞組，每組10只，取相應的細胞懸液0.2 ml，接種在裸鼠右腋部偏后方皮下，SP細胞組和NSP細胞組再隨機分為生理鹽水（NS）組、青蒿素（將青蒿素純品溶解于少量DMSO，再用生理鹽水稀釋到所需濃度）組。

1.7 裸鼠移植瘤實驗 裸鼠接種細胞24 h后，青蒿素組予青蒿素懸液200 mg∕kg灌胃，對照組予0.5 ml NS灌胃，每天1次，連續(xù)給藥32 d。移植瘤體積有差異后每3 d測量一次移植瘤的長∕短徑（a∕b），計算瘤體體積V，V=a×b2∕2。第32天處死裸鼠，剝離瘤體，稱取重量，計算抑瘤率，抑瘤率=（對照組相對重量-實驗組相對重量）∕對照組相對重量×100%。

1.8 免疫組化檢測 Bcl、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白的表達 將瘤組織固定、脫水、透明、包埋，連續(xù)切片；切片脫蠟水化后，作抗原修復，用FBS代替一抗做陰性對照；每張切片加1滴3%H2O2溶液，常溫下孵育，PBS沖洗；每張切片滴加1滴相應一抗，常溫下孵育，PBS沖洗；每張切片滴加1滴聚合物增強劑（試劑A），室溫下孵育，PBS沖洗；每張切片滴加1滴酶標抗鼠∕兔聚合物（試劑B），室溫下孵育，PBS沖洗；每張切片滴加1滴新配置的DAB液，顯微鏡下控制發(fā)色，自來水沖洗終止顯色，復染、脫水透明、封片。結果判斷：（1）陽性細胞百分比（PP）：在400倍的顯微鏡下，取5個不同視野，每個視野計數(shù)3遍，取其平均值，為陽性細胞數(shù)，陽性細胞數(shù)與該視野中細胞總數(shù)的比為陽性細胞百分比。然后取平均值，作為該張切片的PP。無陽性細胞記為0分，PP＜10%記1分；11%～50%記2分；51～75%記3分；＞75%記4分。（2）染色強度（SI）：0分為無色，淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。每張切片的PP×SI為免疫組化評分（IRS）［9］。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗結果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SP細胞的分選 通過流式細胞術，檢測出胃癌SGC-7901細胞中SP細胞所占比為1.53%±0.47%，經(jīng)維拉帕米拮抗后SP細胞所占比為0.1%。

2.2 青蒿素對移植瘤的影響 移植瘤見于接種細胞后第3天。于第5天移植瘤體積出現(xiàn)差異，差異有統(tǒng)計學意義。SP細胞及NSP細胞青蒿素組移植瘤體積均小于NS組（P＜0.05）；NSP細胞NS組移植瘤體積小于SP細胞NS組（P＜0.05），見表1。SP細胞與NSP細胞青蒿素組的抑瘤率分別為55.02%和47.09%，見表2。

表1 裸鼠移植瘤體積比較（n=5，mm3）

表2 裸鼠移植瘤重量及抑瘤率

2.3 免疫組化檢測瘤體中相關蛋白的表達Bcl-2在SP細胞、NSP細胞青蒿素組的表達低于相應NS組；在NSP細胞NS組中的表達低于SP細胞NS組（P＜0.05）；NS組中Caspase-9、Caspase-3、Bax的表達低于相應青蒿素組，在NSP細胞NS組的表達高于SP細胞NS組（P＜0.05），見圖1、表3。

圖1 凋亡相關蛋白的免疫組化圖（SP×400）

表3 凋亡相關蛋白的免疫組化結果（IRS平均分值）

3 討論

腫瘤細胞對西藥的治療逐漸出現(xiàn)耐藥，而這種耐藥卻很難逆轉，對于腫瘤的治療，也開始轉向中藥輔助治療，且中藥對腫瘤的治療有效、副作用低等優(yōu)勢，對腫瘤細胞的抑制作用也得到進一步的了解，通過作用細胞溶酶體、誘導細胞凋亡以及激活機體免疫系統(tǒng)而間接地抑制腫瘤生長［10-13］。

在本次實驗中，再次驗證了胃癌SGC7901細胞中是含有SP細胞，量較少，結合移植瘤的體積及重量，驗證了同等量SP細胞成瘤能力強于NSP細胞。在細胞的線粒體凋亡通路中，蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9扮演著重要的角色，Bcl-2蛋白家族增加細胞線粒體膜通透性，釋放細胞色素C，誘導Caspase-3和Caspase-9發(fā)生級聯(lián)反應，誘導凋亡信號傳導，促進細胞凋亡［14-15］。Bcl-2蛋白家族成員包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax，在細胞中兩者的比例決定著細胞的 凋 亡 與 否［12］。 Caspase-9、Caspase-3 蛋 白 為Caspase家族中的成員，分別為起始和效應Caspase，Caspase-9、Caspase-3蛋白的激活，為細胞凋亡的一個重要特征，當Caspase蛋白高表達時，預示細胞處于一種凋亡狀態(tài)，從而抑制腫瘤生長［16-17］。所以當移植瘤組織中低表達Bcl-2，高表達Bax、Caspase蛋白時，細胞是處于一種高凋亡狀態(tài)，腫瘤生長較慢，相反，則利于腫瘤生長。在本實驗NS組中，相對于NSP細胞組，SP細胞瘤體組織中高表達Bcl-2，低表達Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白，處于一種低凋亡的狀態(tài)，利于腫瘤的生長。SP細胞NS組瘤體的體積大于NSP細胞NS組，SP細胞的成瘤強于NSP細胞，與SP細胞處于一種低凋亡狀態(tài)有關。在SP及NSP細胞組中，青蒿素組的瘤體較NS組小，與瘤體組織中低表達Bcl-2，高表達Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白相關，青蒿素處理后可以逆轉細胞的凋亡狀態(tài)，是細胞由低凋亡狀態(tài)向高凋亡狀態(tài)轉變，從而抑制腫瘤的生長。

經(jīng)過本組基礎實驗發(fā)現(xiàn)，胃癌SGC-7901細胞中是含有極少量的SP細胞，而SP細胞具有高成瘤能力，高成瘤的特性與SP細胞處于一種低凋亡的狀態(tài)有關，青蒿素對SP、NSP細胞裸鼠成瘤具有一定的抑制作用，其機制與通過改變細胞凋亡狀態(tài)，使細胞處于一種高凋亡的狀態(tài)有一定的相關性，從而抑制腫瘤的生長。由于目前對于青蒿素的研究尚處于基礎實驗階段，確切機制尚待探討，望不久可以應用于腫瘤臨床的治療。