劉 宏，陳 迪，2，陳勉華，李貞景，王昌祿,*

(1.天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院/省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室/食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室， 天津 300457；2.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 河南 鄭州 450001)

紅曲霉可以產(chǎn)生大量具有生物活性物質(zhì)的次級代謝產(chǎn)物[1-3]。紅曲色素作為紅曲霉的主要次級代謝產(chǎn)物，具有多種生物活性[4-12]。人們已完成了6種主要紅曲色素的結(jié)構(gòu)鑒定，包括兩種紅色素：紅斑紅曲胺(rubropunctamine，RUM)、紅曲玉紅胺(monascorubramine，MOM)；兩種黃色素：紅曲素(monascin，MS)、紅曲黃素(ankaflavin，AK)；兩種橙色素：紅斑紅曲素(rubropunctatin，RUN)、紅曲玉紅素(monascorubrin，MON)[3]。真菌腎臟毒素——桔霉素的發(fā)現(xiàn)引起了人們對于紅曲霉安全性的爭論，限制了紅曲產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用[13]；因此，在提高紅曲色素產(chǎn)量的同時降低桔霉素產(chǎn)量，對紅曲產(chǎn)品開發(fā)和應(yīng)用具有重要意義。

光作為一種重要信號，可用來調(diào)控絲狀真菌的生長、發(fā)育及次生代謝。不同波長的單色光對絲狀真菌的生長發(fā)育及次級代謝的影響各不相同[14]。大量研究[15-18]表明，不同光源對紅曲霉色素和桔霉素的產(chǎn)生有很大影響，但研究還不夠深入。目前，系統(tǒng)研究不同光源對紅曲霉生長及色素產(chǎn)生的報道并不多見，研究紅光不同光照條件對紅曲色素和桔霉素產(chǎn)生的影響也鮮有報道。本文擬對不同波長單色光特別是紅光對紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)M9生長、色素和桔霉素產(chǎn)量的影響進(jìn)行研究，并從分子水平上初步探討光照培養(yǎng)對紅曲色素和桔霉素代謝機(jī)理的影響，希望為光照發(fā)酵法高產(chǎn)紅曲色素、低產(chǎn)桔霉素提供技術(shù)支撐，為紅曲霉次生代謝途徑研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1菌種來源

紅曲霉菌株(MonascuspurpureusM9)，由天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院發(fā)酵食品與生物資源開發(fā)研究室保藏。

1.1.2主要試劑

葡萄糖、蛋白胨、NaNO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4，天津市化學(xué)試劑一廠；無水乙醇，天津市江天化工技術(shù)有限公司；瓊脂粉，北京索萊寶生物科技公司，以上試劑均為國產(chǎn)分析純。乙腈、甲酸(國產(chǎn)色譜純試劑)，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；GoldviewI型核酸染色劑、6×DNA Loading Buffer、1kb plus DNA Ladder(國產(chǎn)生化試劑)，北京索萊寶生物科技公司；DM2000 Marker(國產(chǎn)生化試劑)，康維世紀(jì)生物科技有限公司；Plant RNA Kit，美國Omega Bio-Tek公司；HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit，康維世紀(jì)生物科技有限公司；SYBR? Premix Ex TaqTM II，Takara(大連)有限公司。

1.1.3主要培養(yǎng)基

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA)：將麥芽磨碎，加入4倍體積水，60 ℃水浴至麥芽糖度為18～20°BX，8層紗布過濾，置于-20 ℃冰箱備用。使用時融化麥芽汁，將糖度調(diào)為10～12°BX，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

種子液培養(yǎng)基：葡萄糖6 g，蛋白胨 2 g，NaNO31 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g，自來水100 mL，乳酸調(diào)pH值至5.5左右，121 ℃滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：大米粉5 g，NaNO30.3 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，KH2PO40.15 g，自來水100 mL，pH值自然，121 ℃滅菌20 min。

固體平板培養(yǎng)基：麥芽糖4 g，可溶性淀粉5 g，蛋白胨 3 g，瓊脂3 g，自來水100 mL，pH值自然，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD型超凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；LRH-250-GII型微電腦控制光照培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠；J-26XP型高速冷凍離心機(jī)，貝克曼庫爾特(中國)有限公司；1200型高效液相色譜儀、MX3000P型實時熒光定量PCR儀，美國安捷倫科技有限公司；KW-T8ZW-12W型LED單色燈(紅光、黃光、綠光和藍(lán)光)，深圳宸華照明有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1菌株保藏和種子液制備

用無菌接種環(huán)挑取紫色紅曲霉M9菌絲，劃線于麥芽汁斜面培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)7～9 d，將活化好的菌種保藏于4 ℃冰箱，一個月活化一次。

向紫色紅曲霉M9試管斜面加入5 mL生理鹽水，用無菌孢子鏟輕輕刮取孢子，制成孢子懸液。將孢子懸液全部倒入種子培養(yǎng)基中，在30 ℃，180 r/min的搖床中培養(yǎng)36～40 h，制成種子液。

1.3.2菌落形態(tài)觀察

將制備好的種子液過8層無菌紗布，得到孢子懸液，通過血球計數(shù)板將孢子濃度調(diào)為106個/mL。取20 μL孢子懸液，單點法加在固體平板培養(yǎng)基中心，待菌液被培養(yǎng)基充分吸收后轉(zhuǎn)入裝有LED單色燈(紅光、黃光、綠光和藍(lán)光)的恒溫培養(yǎng)箱中。調(diào)整光照強(qiáng)度為100 lx，光照組置于光源的正下方，黑暗組避光培養(yǎng)，30 ℃靜置培養(yǎng)10 d，分別在第4、7、10天記錄菌落形態(tài)。

1.3.3液態(tài)發(fā)酵方法和光照條件

將制備好的種子液過8層無菌紗布，得到孢子懸液，調(diào)孢子濃度為106個/mL。將5 mL孢子懸液接種于50 mL的大米液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)10 d。

光照實驗分為兩組。第一組將恒溫培養(yǎng)箱劃分為5個獨(dú)立燈室，每個燈室安裝不同波長的LED單色光(紅光、黃光、綠光和藍(lán)光)。光照強(qiáng)度調(diào)整為100 lx，光照時間為持續(xù)光照，避光室為黑暗培養(yǎng)。第二組將恒溫培養(yǎng)箱劃分為5個獨(dú)立燈室，每個燈室安裝紅色LED單色光，分別在不同光照時間15、30、45、60 min/d，不同光照強(qiáng)度100、200、300、400 lx下培養(yǎng)，避光室為黑暗培養(yǎng)。

1.3.4紅曲色素和桔霉素的提取方法

將發(fā)酵結(jié)束后的紅曲霉菌絲體烘干至恒重，用研缽將其磨成粉末狀，過80目篩。準(zhǔn)確稱取0.500 0 g紅曲粉末樣品，裝入10 mL離心管中，加入4 mL 75%乙醇，振蕩混勻，超聲30 min，3 500 r/min離心10 min，收集上清液于10 mL容量瓶中。向沉淀物中加入3 mL 75%乙醇，混勻，超聲30 min，3 500 r/min離心10 min，收集上清液。再重復(fù)此操作一次，將3次上清液合并，用75%乙醇定容至10 mL。稀釋10倍后，用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾，高效液相色譜(HPLC)法進(jìn)行分析。

1.3.5紅曲色素和桔霉素的HPLC檢測

1.3.5.1 紅曲色素的測定

色譜柱：XDB-C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)；流動相：A泵(水+0.1%甲酸)，B泵(乙腈)。乙腈和水分別過0.45 μm的有機(jī)系濾膜和水系濾膜，脫氣30 min。檢測器：DAD(二極管陣列檢測器)，流速為1 mL/min，檢測波長為410 nm，檢測溫度為25 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。

梯度洗脫方法如表1。

表1 HPLC梯度洗脫流動相比例

1.3.5.2 桔霉素的測定

色譜柱：XDB-C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)；流動相：A泵(水，色譜純甲酸調(diào)pH值為2.5)，B泵(乙腈)。乙腈和水分別過0.45 μm的有機(jī)系濾膜和水系濾膜，脫氣30 min。檢測器為熒光檢測器，流速為1 mL/min，檢測波長為激發(fā)波長(λex)331 nm，發(fā)射波長(λem)500 nm，檢測溫度為25 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。桔霉素檢測采用等度洗脫，流動相中水與乙腈的比例為55%：45%。

1.3.6紅曲色素和桔霉素合成相關(guān)基因表達(dá)量的測定方法

以NCBI(National Center for Biotechnology Information)報道的紅曲霉色素和桔霉素合成相關(guān)基因序列為參考序列。與紅曲霉色素合成相關(guān)的基因有MpPKS5、mppR1、mppA、mppB、mppC、mppD、mppE、mppR2、MpFasA2、MpFasB2、mppF(Gen Bank accession no. KC148521)，與紅曲霉桔霉素合成相關(guān)的基因有orf1、ctnA、orf3、orf4、orf5 (Gen Bank accession no. AB243687)、pksCT(Gen Bank accession no. AB167465)、ctnD、ctnE、ctnF、ctnG、ctnH、ctnI、ctnR(Gen Bank accession no. EU309474)。用NCBI上的Primer-BLAST軟件設(shè)計引物，以β-actin基因作為內(nèi)參基因。

使用Omega廠家生產(chǎn)的Plant RNA Kit提取紅曲霉總RNA，用HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green染色實時熒光定量PCR方法對紅曲色素與桔霉素合成相關(guān)基因相對表達(dá)量進(jìn)行監(jiān)控。擴(kuò)增曲線條件：95 ℃，30 s，1 Cycle；95 ℃，變性5 s，60 ℃，退火30 s，72 ℃，延伸30 s，42 Cycles。溶解曲線條件：95 ℃，15 s，60 ℃，退火30 s，最后，產(chǎn)物在95 ℃延伸15 s，同時在60～95 ℃進(jìn)行溶解曲線分析。采用β-actin基因作為內(nèi)參基因。

1.3.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用SPSS17.0軟件，對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析；用Origin9.0軟件繪圖。每個實驗做3個平行實驗，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05(*)，P<0.01(**)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同單色光對紫色紅曲霉M9菌落形態(tài)的影響

A：持續(xù)黑暗；B：持續(xù)紅光；C：持續(xù)黃光；D：持續(xù)綠光；E：持續(xù)藍(lán)光。從左往右依次為培養(yǎng)第4、7、10天。圖1 持續(xù)光照對紫色紅曲霉M9菌落形態(tài)的影響Fig.1 Effects of continuous light exposure on colony morphology of Monascus purpureus M9

以黑暗培養(yǎng)條件作為對照，研究不同單色光在持續(xù)光照下對紫色紅曲霉M9菌落形態(tài)的影響，結(jié)果如圖1。由圖1可知，相比黑暗條件下，當(dāng)在持續(xù)紅光照射時，第4天時出現(xiàn)很明顯的輻射狀褶皺；隨著培養(yǎng)時間的增加，輻射狀褶皺逐漸增多，在第10天時出現(xiàn)顯著的暗紅色區(qū)域，菌絲更長、更稠密且顏色更深。在持續(xù)藍(lán)光照射下，菌絲顏色為白色，極為稀疏，無輻射狀褶皺出現(xiàn)。在持續(xù)黃光和綠光照射下，菌絲顏色稍淺且無明顯輻射狀褶皺和暗紅色區(qū)域出現(xiàn)。結(jié)合前期研究成果[19]及本研究可以看出：相比黑暗條件，在持續(xù)光照下，紅光可以顯著促進(jìn)紫色紅曲霉M9菌絲生長及菌絲內(nèi)色素的合成；藍(lán)光顯著抑制了菌絲的生長及菌絲內(nèi)色素的合成；黃光和綠光對菌絲生長及菌絲內(nèi)色素的產(chǎn)生有些抑制作用。

2.2 不同單色光對紫色紅曲霉M9紅曲色素產(chǎn)量的影響

*，P<0.05; **,P<0.01。圖2 持續(xù)光照對紫色紅曲霉M9 6種紅曲色素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of continuous light exposure on six monascus pigments production of Monascus purpureus M9

以黑暗培養(yǎng)條件作為對照，研究不同單色光在持續(xù)光照下對紫色紅曲霉M9產(chǎn)生6種色素產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖2。由圖2可以看出，相比黑暗條件，在持續(xù)紅光照射時，6種紅曲色素產(chǎn)量都有增加，兩種紅色素RUM、MOM的產(chǎn)量分別增加了7.86%、17.33%；兩種黃色素MS、AK產(chǎn)量分別增加了11.14%、15.61%；兩種橙色素RUN、MON的產(chǎn)量分別增加了11.47%、16.69%。在持續(xù)黃光照射時，6種色素的產(chǎn)量分別降低了8.28%、24.46%、9.64%、6.57%、10.21%、15.6%；在持續(xù)綠光照射時，6種色素產(chǎn)量分別降低了8.41%、30.62%、11.43%、8.34%、33.56%、57.71%；而在持續(xù)藍(lán)光照射時，6種色素產(chǎn)量降低得更為顯著，分別降低了47.43%、36.75%、48.22%、52.31%、73.84%、60.71%。由此可知，持續(xù)紅光照射增加了紫色紅曲霉M9 6種色素的產(chǎn)量，而持續(xù)黃光、綠光、藍(lán)光照射都減少了紫色紅曲霉M9 6種色素的產(chǎn)量。

不同單色光對紫色紅曲霉M9菌落形態(tài)及色素產(chǎn)量影響結(jié)果表明，紅光是最顯著促進(jìn)紅曲霉生長以及色素產(chǎn)生的光源。據(jù)文獻(xiàn)報道，不同光照時間和光照強(qiáng)度是影響紅曲色素產(chǎn)生的主要因素[11]，因此，后續(xù)實驗中，主要研究不同紅光照射條件對紅曲色素和桔霉素產(chǎn)量及相關(guān)基因表達(dá)量的影響。

2.3 紅光不同光照時間對紫色紅曲霉M9色素及桔霉素產(chǎn)量的影響

圖3 紅光不同光照時間對紫色紅曲霉M9色素和桔霉素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of red light with various illumination time on monascus pigments and citrinin production of Monascus purpureus M9

以黑暗培養(yǎng)條件作為對照，研究紅光不同光照時間對紫色紅曲霉M9色素及桔霉素產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖3。由圖3可知，隨著紅光光照時間的增加，兩種紅色素RUM、MOM和兩種黃色素MS、AK產(chǎn)量都呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，而兩種橙色素RUN、MON產(chǎn)量呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢；桔霉素產(chǎn)量的變化趨勢與橙色素相似。相比黑暗條件下，在紅光不同光照時間下，兩種紅色素和兩種黃色素的產(chǎn)量都有顯著增加，而兩種橙色素及桔霉素的產(chǎn)量卻顯著降低。由此分析可知，相比黑暗條件，紅光不同光照時間可以促進(jìn)RUM和MOM以及MS和AK的產(chǎn)生而抑制RUN和MON的產(chǎn)生，同時也抑制了桔霉素的產(chǎn)生。當(dāng)紅光光照時間為30 min/d時，RUM和MOM產(chǎn)量分別增加了36.01% 和 55.72%，MS 和 AK產(chǎn)量分別增加了29.67% 和 37.92%，RUN和MON產(chǎn)量分別降低了27.83% 和 29.42%；桔霉素產(chǎn)量降低了25.39%。本研究表明，紅光照射30 min/d為最佳的高產(chǎn)紅曲色素低產(chǎn)桔霉素的光照時間。

2.4 紅光不同光照強(qiáng)度對紫色紅曲霉M9色素及桔霉素產(chǎn)量的影響

圖4 紅光不同光照強(qiáng)度對紫色紅曲霉M9色素和桔霉素產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of red light with various illumination intensities on monascus pigments and citrinin production of Monascus purpureus M9

*，P<0.05; **,P<0.01。圖5 紅光不同光照條件對紫色紅曲霉M9紅曲色素和桔霉素合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of red light with different illumination conditions on expressions of monascus pigments and citrinin biosynthetic genes of Monascus purpureus M9

以黑暗培養(yǎng)條件作為對照，研究紅光不同光照強(qiáng)度對紫色紅曲霉M9色素及桔霉素產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖4。由圖4可知，隨著紅光光照強(qiáng)度的增加，兩種紅色素RUM、MOM和兩種黃色素MS、AK的產(chǎn)量都呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，而兩種橙色素RUN、MON產(chǎn)量呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢；桔霉素產(chǎn)量的變化趨勢與橙色素相似。相比黑暗條件下，在紅光不同光照強(qiáng)度下，兩種紅色素和兩種黃色素的產(chǎn)量都顯著增加，而兩種橙色素和桔霉素的產(chǎn)量顯著降低。由此分析可知，相比黑暗條件下，紅光不同的光照強(qiáng)度可促進(jìn)RUM和MOM及MS和AK的產(chǎn)生，抑制RUN和MON的產(chǎn)生，對桔霉素的產(chǎn)生也有抑制作用。當(dāng)紅光光照強(qiáng)度為300 lx時，RUM和MOM產(chǎn)量分別增加了54.32%和71.51%，MS和AK產(chǎn)量分別增加了42.28%和59.72%，RUN和MON產(chǎn)量分別降低了41.94%和54.63%；桔霉素產(chǎn)量降低了40.19%。本研究表明，紅光300 lx光照強(qiáng)度為最佳的高產(chǎn)紅曲色素低產(chǎn)桔霉素的光照強(qiáng)度。

2.5 紅光不同光照條件對紅曲色素和桔霉素合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響

以黑暗培養(yǎng)條件作為對照，研究紅光不同光照條件對紅曲色素和桔霉素合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響，結(jié)果如圖5。由圖5(a1)、(a2)和(b1)、(b2)可知，在紅光不同光照時間下，紅曲色素合成相關(guān)基因mppA/B/D/F、mppR1/R2、MpPKS5、MpFasA2/B2的基因表達(dá)量由高到低依次為黑暗，15、60、45、30 min/d，而mppC、mppE的基因表達(dá)量由高到低依次為30、45、60、15 min/d，黑暗；在紅光不同光照強(qiáng)度下，紅曲色素合成相關(guān)基因mppA/B/D/F、mppR1/R2、MpPKS5、MpFasA2/B2的基因表達(dá)量由高到低依次為黑暗，100、200、400、300 lx，而mppC、mppE的基因表達(dá)量由高到低依次為300、400、200、100 lx，黑暗。結(jié)合圖3和圖4，紅光不同光照時間和強(qiáng)度對紅曲色素產(chǎn)量的影響可推測，mppA/B/D/F、mppR1/R2、MpPKS5、MpFasA2/B2的基因表達(dá)量變化趨勢與紅曲色素中兩種橙色素產(chǎn)量的變化趨勢呈正相關(guān)，mppC、mppE的基因表達(dá)量變化趨勢與紅曲色素中兩種紅色素和兩種黃色素產(chǎn)量的變化趨勢呈正相關(guān)。由此分析可初步推測，在紅光照射條件下，mppA/B/D/F、mppR1/R2、MpPKS5、MpFasA2/B2可能參與了橙色素的生物合成，而mppC、mppE可能參與了紅色素和黃色素的生物合成。

由圖5(c1)、(c2)和(d1)、(d2)，結(jié)合圖3和圖4，同理可推測出，桔霉素合成相關(guān)基因ctnA/D/E/F/G/H/I、orf1/3/4/5、pksCT的基因表達(dá)量與桔霉素的產(chǎn)量呈正相關(guān)，而ctnR1的基因表達(dá)量與桔霉素的產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)。通過分析結(jié)果可初步推測，在紅光照射條件下，ctnA/D/E/F/G/H/I、orf1/3/4/5、pksCT可能參與了桔霉素的合成代謝，而ctnR1可能參與了桔霉素的分解代謝。

3 結(jié) 論

通過研究不同單色光對紫色紅曲霉M9菌落形態(tài)和6種紅曲色素產(chǎn)量的影響及紅光不同照射條件對6種紅曲色素和桔霉素產(chǎn)量及相關(guān)基因表達(dá)量的影響，可得出結(jié)論：1)相比黑暗條件，在持續(xù)光照下，紅光是最顯著的促進(jìn)紫色紅曲霉M9菌絲生長及色素產(chǎn)生的光源。2)高產(chǎn)紅曲色素低產(chǎn)桔霉素的最佳紅光光照時間為30 min/d，最佳光照強(qiáng)度為300 lx。3)初步推測紅曲霉M9色素合成相關(guān)基因mppA/B/D/F、mppR1/R2、MpPKS5、MpFasA2/B2可能參與兩種橙色素的生物合成，而mppC、mppE可能參與兩種紅色素和兩種黃色素的生物合成；ctnA/D/E/F/G/H/I、orf1/3/4/5、pksCT可能參與桔霉素的合成代謝，而ctnR1可能參與桔霉素的分解代謝。

今后，可深入研究紅光調(diào)控紫色紅曲霉M9產(chǎn)生紅曲色素和桔霉素機(jī)理，為光照發(fā)酵法提高紅曲色素產(chǎn)量、降低桔霉素生成機(jī)制提供依據(jù)，為進(jìn)一步研究光照調(diào)控其他絲狀真菌的次級代謝提供參考。