孫景權，嚴 翊，李松波，謝敏豪

（1．四川大學 體育學院，四川 成都 610065；2．北京體育大學，北京100084；3．國家體育總局運動醫(yī)學研究所，北京100061）

長時間耐力訓練能夠增加骨骼肌細胞中甘油三酯（triglyceride，TG）含量。早在 1969年，研究者就發(fā)現(xiàn)訓練程度較高的運動員其骨骼肌肌細胞甘油三酯含量（intramyocellular triglyceride，IMTG）也增高（Hoppeler et al.,1985; Morgan et al.,1969）。Goodpaster等（2001）發(fā)現(xiàn)，與健康靜坐少動的中年瘦人相比，長期耐力鍛煉人群肌肉內(nèi)脂質(zhì)含量顯著增高，同時骨骼肌氧化能力（琥珀酸脫氫酶含量）較高。但是耐力訓練增加骨骼肌細胞中 TG含量的機制還不清楚。

乳酸被認為是運動過程中代謝的中間產(chǎn)物，主要被用于糖異生底物和進入三羧酸循環(huán)氧化產(chǎn)生 ATP。近年研究發(fā)現(xiàn)，乳酸還是機體一個重要信號物質(zhì)，在細胞中發(fā)揮信號分子作用。研究發(fā)現(xiàn)，生理濃度范圍內(nèi)（1～20 mM）的乳酸能夠明顯抑制小鼠及大鼠脂肪細胞以及人體脂肪細胞的脂解作用（Liu et al.,2009）。其中具體機制是乳酸與其受體——G蛋白偶聯(lián)受體81（G protein-coupled receptors 81，GPR81）結(jié)合后，以自分泌形式抑制 Gi-介導腺苷酸環(huán)化酶，導致cAMP產(chǎn)量降低，降低cAMP-PKA信號通路，進而表現(xiàn)為抗脂解作用（Ahmed et al.,2010）。在體實驗發(fā)現(xiàn)，乳酸（30 mM）抑制異丙腎上腺素誘發(fā)的小鼠白色脂肪水解，但是這種現(xiàn)象在 GPR81-/-小鼠中未觀察到，同時乳酸抑制Forskolin誘發(fā)cAMP堆積（Sakurai et al., 2014）。有學者認為，乳酸/GPR81信號軸可能參與運動過程中供能底物的轉(zhuǎn)換。這些結(jié)果均提示，乳酸通過結(jié)合GPR81降低脂肪組織脂解作用，并且可能參與運動脂肪代謝。那么，運動過程中骨骼肌組織堆積的乳酸是否通過結(jié)合其受體GPR81，進而參與運動訓練誘導骨骼肌細胞 TG的堆積，目前還不清楚。

在細胞培養(yǎng)實驗中，電脈沖刺激（electrical pulse stimulation, EPS）分化成的骨骼肌細胞（肌管）能夠替代神經(jīng)電信號激活骨骼肌纖維（Fujita et al.,2007; Thelen et al.,1997）。目前大部分 EPS誘導細胞收縮模型能夠用于研究骨骼肌的一些適應性變化（Nikolic et al.,2012）。機體內(nèi)，長時間低頻率 EPS能夠?qū)е驴旒√墙徒庑图±w維向慢肌氧化型肌纖維轉(zhuǎn)化（Pette et al.,1992）。Aas等（2002）報道，在高糖和低糖情況下，一次性 EPS可以改善原代培養(yǎng)骨骼肌細胞對葡萄糖的敏感性。

本研究通過觀察乳酸/GPR81信號通路是否參與調(diào)節(jié)EPS誘發(fā) C2C12肌管細胞收縮誘導 TG含量增加，發(fā)現(xiàn)乳酸/GPR81信號通路在運動訓練誘導骨骼肌細胞 TG堆積中發(fā)揮重要作用。

1 研究對象與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

小鼠成肌細胞細胞株C2C12，接種于含培養(yǎng)基的100 mm培養(yǎng)皿中，在 37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基包含高糖 DMEM（SH30022.01, Hyclone）、10%胎牛血清/FBS（VS500T, 上海威正翔禹生物科技有限公司）、1%青鏈霉素混合液（KGY0023, 江蘇凱基生物技術有限公司）。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（KGY0012, 江蘇凱基生物技術有限公司）進行細胞消化。將細胞鋪入 6孔板（3335, 康寧公司），當6孔板中細胞融合達到90%～95%時，將C2C12細胞培養(yǎng)基更換為分化培養(yǎng)基（高糖DMEM,2%馬血清,1%青鏈霉素混合液），每24 h更換一次分化培養(yǎng)基。細胞分化4～6天后，分化完成的肌管細胞用于藥物處理和EPS處理。

1.2 藥物處理

C2C12細胞分化 4～6天后，使用乳酸鈉（L7022,Sigma）或者 Sodium 3-hydroxybutyrate/3-OBA（54965,Sigma）處理肌管細胞。另外，在抑制劑實驗中，每次 EPS進行前 1 h，采用 3-OBA預處理細胞 1 h。3-OBA作為GPR81受體抑制劑，能夠抑制細胞膜上 GPR81受體活性（Shen et al.,2015）。Sodium 3-hydroxybutyrate/ 3-OBA和乳酸鈉均溶解在H2O中待用，儲存濃度為1 M。

1.3 EPS方案

使用細胞培養(yǎng)刺激系統(tǒng) C-Pace EP culture pacer（IonOptix）產(chǎn)生 EPS使肌管細胞收縮。此儀器能夠發(fā)出雙極性脈沖到懸掛在培養(yǎng)基中的C-dish碳電極上。EPS方案如下：EPS每天一次，共持續(xù)4天。第1天和第2天，電壓14 V，單次刺激時長2 ms，頻率1 Hz，電刺激總時間2 h；第3天和第4天：電壓30 V，單次刺激時長2 ms，頻率分別為0.5 Hz和1 Hz，電刺激總時間3 h（表1）。EPS前1 h，每孔更換2 ml新分化培養(yǎng)基。根據(jù)以往研究（Burch et al.,2010），在最后一次電刺激3 h后收集細胞提取總RNA；分別在最后一次電刺激后12 h、24 h和36 h收集細胞，使用裂解液后提取蛋白質(zhì)和進行TG含量測試。

表1 EPS方案Table 1 The Protocol of Electrical Pulse Stimulation

1.4 蛋白質(zhì)提取及濃度測定

細胞中加入裂解液（110000-L2，北京賽馳生物科技有限公司）充分裂解，4℃離心，12 000 g，15 min，將上清分裝至預冷離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩？偟鞍诐舛葴y定采用BCA蛋白定量分析試劑盒（Prod# 23225, 賽默飛世爾科技有限公司），采用 BSA作為標準液制作標準曲線，測試方法依照說明書進行。

1.5 肌管細胞中TG含量測試

采用組織甘油三酯酶法測定試劑盒（E1003，北京普利萊基因技術有限公司）進行測試，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。樣品中相對 TG含量使用細胞總蛋白濃度進行校準。

1.6 肌管細胞中乳酸含量測試

細胞中乳酸含量測定使用乳酸比色法測定試劑盒（K607-100, 艾美捷科技有限公司），測試方法依照說明書進行。樣品中相對乳酸含量使用細胞總蛋白濃度進行校準。

1.7 肌管細胞中ATP含量測試

細胞中ATP含量測定使用ATP檢測試劑盒（S0026,上海碧云天生物技術有限公司），用 GloMax? 20/20 Luminometer化學發(fā)光檢測儀（E5311, 美國 Promega-GloMax Promega GloMax）測定RLU值，試劑準備和操作依照說明書進行。相對ATP含量使用樣品中總蛋白濃度校準。

1.8 Western blot 檢測蛋白表達量

每樣品孔加 50～100 μg細胞總蛋白，然后進行 SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜2 h；5%BSA緩沖液（含0.05% Tween-20）封閉1 h；經(jīng)一抗和二抗孵育后加底物顯影液（#34080,賽默飛世爾科技有限公司）進行曝光。蛋白名稱及試劑提供公司如下：pCREB-1（Ser 133, sc-101663）和β-actin（C4,sc-47778）購買于Santa Cruz Biotechnology；CREB（ab7540）購買于Abcam。采用ChemiDocTMMP System全能型成像系統(tǒng)（1708280, Bio-Rad）進行蛋白凝膠檢測。β-actin作為內(nèi)參蛋白，Image Lab Software 4.0分析條帶灰度值。

1.9 RT-PCR檢測mRNA含量

細胞中總 RNA提取采用 TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（9767, Takara），操作步驟按照試劑盒說明書進行。

總RNA濃度的測定：使用微量分光光度計（NanoDrop 2000）測定總 RNA濃度，純度要求：A260/A280比值在1.9～2.0 之間，RNA 濃度= A260×稀釋倍數(shù)×0.04 μg/μl。根據(jù)各個樣品RNA濃度將其濃度統(tǒng)一配成100 ng/μl。

逆轉(zhuǎn)錄：mRNA（100 ng/μl）使用PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）（RR036A, Takara）進行逆轉(zhuǎn)錄。

實時定量 RT-PCR：使用 SYBR? Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）（RR820A, Takara）試劑盒檢測MyHCI、MyHCIIa、MyHCIIx、MyHCIIb 和 18S rRNA mRNA含量，并且用核糖體 18S1 RNA作為內(nèi)參校準基因，引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司，序列見表2。定量方法用 2—△△Ct表示基因的表達量，計算公式△△Ct=[Ct（實驗組目的基因）－Ct（18S1）]－[Ct（對照組目的基因）－Ct（18S1）]。

表2 引物序列表Table 2 The Sequence of Primer

1.1 0 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準誤（M±SEM）表示，用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行處理。組間比較采用單因素方差分析（Oneway ANOVA），同時采用雙因素方差分析（Univariate法）檢測抑制劑和 EPS之間交互作用，顯著水平取P＜0.05，非常顯著水平取P＜0.01。作圖軟件采用GraphPad Prism 5。

2 結(jié)果

2.1 乳酸對C2C12肌管細胞中TG含量的影響

不同濃度的乳酸（4、16、32、64 mM）處理C2C12細胞4.5 h后，采用比色法檢測TG含量。結(jié)果如圖1所示，與對照組相比，4、16和64 mM的乳酸處理C2C12細胞，肌管細胞中TG含量均出現(xiàn)顯著增加（P＜0.05），32 mM乳酸處理細胞后，TG含量出現(xiàn)非常顯著增加（P＜0.01）。

圖1 乳酸對C2C12肌管細胞中TG含量的影響Figure 1. The Effect of Lactate Treatment on TG Contents in C2C12 myotubes注：*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2 乳酸對C2C12肌管細胞中cAMP-PKA信號通路活性的影響

16 mM乳酸處理肌管細胞，采用Western Blot方法檢測不同時間點（10 min、20 min和30 min）后細胞中pCREB和 CREB蛋白水平變化。結(jié)果如圖 2所示，與對照組相比，16 mM乳酸處理C2C12肌管細胞后，細胞中CREB的磷酸化水平非常顯著降低（P＜0.01），這一作用在處理細胞10 min、20 min和30 min均有表現(xiàn)。數(shù)據(jù)表明，乳酸在C2C12肌管細胞中同樣能夠降低 cAMP-PKA信號通路活性。2.3 一次性 EPS對 C2C12肌管細胞中乳酸和 ATP含量的影響

圖2 乳酸對C2C12肌管細胞中cAMP-PKA信號通路活性的影響Figure 2. The Effect of Lactate Treatment on cAMP-PKA Signaling Pathway Activities in C2C12 Myotubes注：每組n=6，**P＜0.01。

EPS之前和一次性 EPS后即刻收集細胞，采用比色法檢測細胞中乳酸含量。結(jié)果顯示，相對于未刺激組細胞，一次性的電壓30 V、頻率分別0.5 Hz和1 Hz、單次時長2 ms、共3 h的電刺激，均能夠非常顯著增加C2C12肌管細胞中乳酸含量（P＜0.01，圖3）。

圖3 一次性EPS方案對C2C12肌管細胞中乳酸含量的影響Figure 3. The Effect of Acute EPS on the Lactate Contents in C2C12 Myotubes注：每組n=6，**P＜0.01。

EPS之前和一次性 EPS后即刻收集細胞，采用化學發(fā)光法檢測細胞中ATP含量。結(jié)果如圖4所示，相對于未刺激組細胞，一次性的電壓30 V，頻率1 Hz，單次時長2 ms，共3 h的 EPS電刺激顯著降低電刺激即刻 C2C12肌管細胞中ATP含量（P＜0.05）。并且，頻率 0.5 Hz的 EPS電刺激能夠非常顯著降低肌管細胞中ATP含量（P＜0.01）。這些數(shù)據(jù)表明，EPS可使 C2C12肌管細胞出現(xiàn)收縮，并消耗 ATP作為能源供應，同時能夠使C2C12肌管細胞中乳酸顯著升高。

圖4 一次性EPS方案對C2C12肌管細胞中ATP含量的影響Figure 4. The Effect of Acute EPS on ATP Levels in C2C12 Myotubes注：每組n=6，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.4 不同EPS方案對C2C12肌管細胞中肌球蛋白重鏈亞型mRNA含量的影響

分化 4～6天的肌管細胞按照 EPS方案進行電脈沖刺激。將C2C12肌管細胞分為對照組（Control）、30 V 0.5 Hz 2 ms和30 V 1 Hz 2 ms組，最后一次電刺激后3 h收集細胞，提取總RNA。采用RT-PCR方法檢測肌球蛋白重鏈亞型 MyHCI、MyHCIIa、MyHCIIb和 MyHCIIx 的 mRNA 含量。結(jié)果如圖 5所示，與未電刺激組相比，電壓 30 V、頻率0.5 Hz和/或1 Hz、單次時長2 ms共3 h的電刺激均能夠顯著增加氧化型蛋白重鏈 I型（MyHCI）mRNA含量（P＜0.05）和快肌纖維標志性肌球蛋白重鏈 IIb型（MyHCIIb）mRNA 含量（P＜0.05），而對 MyHCIIa和MyHCIIx 的mRNA含量影響不明顯。這些結(jié)果表明，EPS觸發(fā)骨骼肌纖維類型的重新裝配，電壓30 V、頻率0.5 Hz和/或1 Hz、單次時長2 ms共3 h的EPS能夠顯著增加C2C12肌管細胞氧化型和快速收縮型肌纖維含量。

圖5 不同EPS方案對C2C12肌管細胞肌球蛋白重鏈亞型mRNA含量的影響Figure 5. The Effect of Different EPS Protocols on the mRNA Levels of the Myosin Heavy Chain Subtypes in C2C12 Myotubes注：每組n=3，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.5 EPS誘發(fā)C2C12肌管細胞中TG堆積模型建立

采用兩種 ESP方案刺激肌管細胞，分別在每組電刺激后的12 h、24 h和36 h收集細胞，采用比色法檢測細胞中TG含量。結(jié)果如圖6所示，與未電刺激組相比，電刺激后12 h和24 h兩組肌管細胞中TG含量均沒有出現(xiàn)變化（P＞0.05）；而電刺激后36 h，30 V 0.5 Hz 2 ms組細胞中TG含量顯著增加（P＜0.05），30 V 1 Hz 2 ms組細胞中TG含量非常顯著增加（P＜0.01）?；谶@一結(jié)果，我們認為，電壓30 V、頻率0.5 Hz或/和1 Hz、單次時長2 ms、電刺激后36 h收集細胞的方案能夠作為EPS誘發(fā)C2C12肌管細胞中TG堆積的模型。

圖6 EPS處理后不同時間點C2C12肌管細胞中TG含量的變化Figure 6. The Changes of TG Contents at Different Time Points after EPS Treatment in C2C12 Myotubes注：每組n=6，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.6 乳酸/GPR81信號通路參與調(diào)節(jié) EPS誘發(fā) C2C12肌管細胞TG堆積

分化 4～6天的肌管細胞，每天 EPS之前采用 GPR81的抑制劑3-OBA（6 mM）預處理1 h。然后按照EPS方案進行電脈沖刺激。電刺激后36 h收集細胞，采用比色法檢測 C2C12肌管細胞中TG含量。結(jié)果如圖7所示，相對于未刺激組，30 V 0.5 Hz 2 ms的EPS有增加C2C12肌管細胞中TG含量的趨勢（P=0.052）；30 V 1 Hz 2 ms的EPS能夠非常顯著增加 C2C12肌管細胞中 TG含量（P＜0.01）。與30 V 1 Hz 2 ms 組相比，3-OBA+30 V 1 Hz 2 ms組C2C12肌管細胞中TG含量顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，用6 mM 3-OBA抑制C2C12肌管細胞GPR81活性后，30 V 1 Hz 2 ms的EPS誘發(fā)TG堆積的能力減弱；在30 V 0.5 Hz 2 ms的EPS方案中TG有下降趨勢，但差異不夠顯著（P＞0.05）。另外，采用Univariate法分析3-OBA和EPS對TG含量影響發(fā)現(xiàn)，3-OBA這一變量對 TG含量無影響（P＞0.05），EPS這一變量對 TG含量有非常顯著影響（P＜0.01），3-OBA和 EPS之間存在交互作用（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，3-OBA本身對 C2C12肌管細胞 TG含量無影響，EPS能夠顯著增加C2C12肌管細胞TG含量，當EPS和3-OBA同時作用時出現(xiàn)交互作用，3-OBA能夠起到減弱EPS誘發(fā)C2C12肌管細胞 TG增加的作用，說明乳酸/GPR81信號通路參與調(diào)節(jié)EPS誘發(fā)C2C12肌管細胞中TG的堆積。

圖7 乳酸/GPR81信號通路參與調(diào)節(jié)EPS誘發(fā)C2C12肌管細胞中TG堆積Figure 7. Lactate/GPR81 Signaling Pathway was Involved in the Regulation of TG Accumulation Induced by EPS in C2C12 Myotubes注：每組n=6，與Control比，**P＜0.01；與30 V 1 Hz 2 ms組相比，#P＜0.05。

3 分析與討論

骨骼肌細胞中TG是有氧耐力運動過程中骨骼肌細胞的主要能源物質(zhì)。研究報道，運動訓練能夠增加骨骼肌細胞中 TG含量和增強線粒體氧化功能，即 ATP產(chǎn)生的能力（Amati et al.,2011; Goodpaster,et al.,2001）。早在1969年，研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，訓練程度較高且胰島素敏感性較高的運動員其 IMTG含量也增高（Hoppeler et al.,1985; Morgan et al,1969）。Amati等（2011）也同樣發(fā)現(xiàn)，相對正常體重靜坐少動人群，正常體重耐力運動員（有氧鍛煉≥5次/周）骨骼肌肌細胞間脂滴中 TG和DAG顯著較高，同時伴隨胰島素敏感性顯著增加。同時，研究發(fā)現(xiàn)，長期進行耐力運動將導致骨骼肌細胞中TG含量增加和線粒體脂肪酸氧化能力增強。Pruchnic等（2004）發(fā)現(xiàn)，12周的中等強度有氧鍛煉（≥3次/周，前 4周：50%～60% V?O2max強度，30 min/ 次；5～8 周：50%～60% V?O2max強度，40 min/次；9～12 周：70%V?O2max，40 min/次）顯著增加靜坐少動老年人骨骼肌肌細胞間TG含量、SDH含量和I型肌纖維數(shù)量比例，骨骼肌氧化能力顯著增加。但是目前關于運動誘導骨骼肌細胞脂滴堆積和線粒體功能增加的分子機制還不清楚。

運動過程中乳酸大量堆積，從安靜狀態(tài)下 0.5～2 mM到高強度無氧運動后 10～20 mM（Cheetham et al.,1986;Hughson et al.,1987; Kamijo et al.,2000; Ohkuwa et al.,1984）。乳酸作為葡萄糖代謝產(chǎn)物，長期以來被認為是葡萄糖無氧酵解的副產(chǎn)物或是廢物，主要被用于作為能源物質(zhì)進入三羧酸循環(huán)產(chǎn)生 ATP或者是在肝臟中糖異生成葡萄糖（Cori et al.,1935; Issekutz et al.,1965; Kamijo et al.,2000; Miller et al.,1964）。近年來，學者們注意到乳酸一個新的角色——分子信號物質(zhì)（Kuei et al.,2011; Lam et al.,2005），如乳酸通過結(jié)合其受體，降低細胞內(nèi) cAMP合成（IC50是 29 mM）（Lauritzen et al.,2014,2015）和神經(jīng)元鈣誘發(fā)峰值（IC50是4.2 mM）（Bozzo et al.,2013）。本研究采用C2C12肌管細胞模型研究乳酸對骨骼肌細胞 TG含量的影響。結(jié)果表明，在細胞培養(yǎng)水平上，生理濃度范圍內(nèi)的乳酸增加了肌管細胞中TG堆積。由此說明，乳酸在調(diào)節(jié)骨骼肌細胞TG含量方面起著信號分子的作用。

本研究進一步發(fā)現(xiàn)，乳酸可能通過激活其受體 GPR81來誘發(fā)C2C12肌管細胞中TG堆積。GPR81是一種孤立的G蛋白偶聯(lián)受體，主要在脂肪組織中表達，分化后的3T3L1脂肪細胞中也高表達，同時在肝臟、腎臟、骨骼肌和棕色脂肪組織中也有少量表達（Liu et al.,2009）。Bjorntorp（1965）發(fā)現(xiàn)3 mM和20 mM乳酸濃度能夠抑制去甲腎上腺素誘發(fā) SD大鼠附睪周圍脂肪墊釋放甘油和脂肪酸作用。乳酸被確認是GPR81的內(nèi)源性配體（Cai et al.,2008; Liu et al,2009）。進一步研究發(fā)現(xiàn)，乳酸激活 GPR81的EC50大約是5 mM，而且在生理濃度范圍內(nèi)（1～20 mM）乳酸均能夠激活 GPR81（Kuei et al.,2011）。cAMP-PKA信號通路激活會導致脂肪分解和抑制脂肪合成（Hwang et al.,2015）。在脂肪細胞中，乳酸激活 GPR81進而抑制 cAMPPKA信號通路，從而抑制脂解作用和誘導 TG堆積（Ahmed et al.,2010; Cai et al.,2008; Liu et al.,2009; Sakurai et al.,2014）。另有研究發(fā)現(xiàn)，乳酸抑制野生型小鼠脂肪細胞脂解作用，而對 GPR81敲除小鼠并未發(fā)現(xiàn)類似效果（Liu et al.,2009）。同時，研究也認為，乳酸能夠降低白色脂肪組織中脂肪酶活性（Bjorntorp,1965）。這些研究均表明，在生理濃度情況下，乳酸誘導人類、小鼠和大鼠脂肪細胞中TG堆積（Ahmed et al.,2010）。本研究數(shù)據(jù)表明，乳酸/GPR81信號通路同樣在 C2C12肌管細胞中起作用，乳酸可能通過激活GPR81從而抑制cAMP信號通路，進而達到誘導TG堆積效果。

近年來，骨骼肌細胞 EPS模型常被用作在體外進一步探究運動引起骨骼肌適應性變化的分子機制模型（Burch et al.,2010; Fujita et al.,2007; Nedachi et al.,2008,2009; Park et al.,2008; Silveira et al.,2006）。在細胞培養(yǎng)實驗中，EPS分化成功的骨骼肌細胞（肌管）能夠替代神經(jīng)電信號激活骨骼肌纖維（Fujita et al.,2007; Thelen et al.,1997）。本研究采用EPS誘發(fā) C2C12肌管細胞收縮，模擬運動誘導的骨骼肌收縮，進一步觀察運動代謝產(chǎn)物乳酸及其受體GPR81在運動誘導骨骼肌細胞 TG堆積中的作用。首先本研究采用的EPS方案為：分化 4～6天的肌管細胞，先進行 2天 EPS（電壓14 V，單次刺激時長2 ms，頻率1 Hz，電刺激總時間 2 h/天），其目的是利用此 EPS方案來加速 C2C12肌管與肌小節(jié)的生成（Fujita et al.,2007）；第3天和第4天分別進行一次性高電壓不同頻率刺激（電壓：30 V，單次刺激時長2 ms，頻率分別為0.5 Hz和1 Hz，電刺激總時間3 h）。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一次性 EPS方案（電壓 30 V、頻率 0.5 Hz和1 Hz、脈沖 2 ms、共3 h）能夠顯著增加EPS后即刻細胞內(nèi)乳酸含量，同時降低細胞內(nèi) ATP含量，這說明本研究采用的EPS能夠成功誘發(fā)C2C12肌管細胞收縮。另外，運動訓練可誘發(fā)骨骼肌出現(xiàn)適應性變化，包括相關代謝基因表達變化。研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌細胞氧化能力與肌球蛋白重鏈I和IIa型含量密切相關，這些氧化能力強且耐力高的骨骼肌纖維被稱為I和IIa型肌纖維；相反，IIx和 IIb型骨骼肌纖維具有快速收縮特性，肌球蛋白重鏈亞型IIx和IIb是這一骨骼肌類型的標志物（Pette et al.,2000,2001）。肌球蛋白重鏈亞型基因表達情況，常被用于區(qū)分骨骼肌纖維類型的不同（Spangenburg et al.,2003）。有研究報道，電壓30 V、頻率1 Hz、脈沖時長2 ms共24 h或者48 h EPS能夠顯著增加 MyHCI（慢縮氧化型肌纖維標志物）（Nikolic et al.,2012）。本研究數(shù)據(jù)也顯示，電壓30 V、頻率0.5 Hz/1 Hz、單次時長2 ms共3 h的EPS能夠顯著增加氧化型肌纖維標志物 MyHCI和快縮型肌纖維標志物MyHCIIb，這說明這一 EPS方案能夠顯著增加骨骼肌氧化型和快速收縮型肌纖維含量。本研究還發(fā)現(xiàn)，EPS方案（電壓14 V、頻率1 Hz、單次時長2 ms、每天2 h共2天，和電壓30 V、頻率0.5 Hz/ 1 Hz、單次時長2 ms、每天3 h共2天，電刺激后36 h收集細胞）均能夠顯著誘發(fā)骨骼肌細胞中 TG堆積，表明采用該 EPS方案在細胞水平上模擬運動誘發(fā)骨骼肌細胞收縮 TG堆積模型是成功的。因此，此EPS方案可以用于研究乳酸/GPR81信號通路是否參與運動誘導骨骼肌 TG堆積過程，而且它也將是研究長時間耐力訓練增加骨骼肌細胞TG含量的機制的成功細胞模型。

在 EPS模型成功建立的基礎上，本研究進一步探討了乳酸/GPR81信號通路在EPS誘發(fā)C2C12肌管細胞TG堆積中承擔的角色。本研究采用長時間EPS使C2C12肌管細胞收縮誘發(fā) TG堆積。當使用 GPR81的抑制劑 3-OBA抑制C2C12肌管細胞膜上GPR81活性后，EPS誘發(fā)TG堆積的效果減弱。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸/GPR81信號通路通過抑制cAMP產(chǎn)量，降低PKA活性從而抑制脂滴分解作用（Ahmed et al.,2010; Feingold et al.,2011; Langin,2010），即乳酸能夠通過其受體GPR81來抑制脂滴分解。另外，Nikooie等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，高強度間歇運動（high intensity interval training，HIIT）誘發(fā)的乳酸堆積參與調(diào)節(jié)運動后骨骼肌細胞中 TG恢復和增加?；谝陨涎芯?，研究認為，乳酸/GPR81信號通路參與調(diào)節(jié)EPS誘發(fā)C2C12肌管細胞TG堆積過程，即乳酸是運動誘發(fā)骨骼肌脂滴堆積的分子信號物質(zhì)。

本研究從運動代謝產(chǎn)物乳酸角度，解釋耐力訓練導致骨骼肌細胞中 TG含量增加的機制。研究結(jié)果將為開展長時間運動鍛煉誘導骨骼肌細胞中能源物質(zhì) TG堆積的機制研究提供新思路，同時為研究乳酸/GPR81信號通路是否參與調(diào)節(jié)長時間運動鍛煉誘導骨骼肌細胞中能源物質(zhì) TG堆積奠定基礎。另外，通過研究骨骼肌細胞中是否存在乳酸/GPR81信號通路，以及它對骨骼肌脂肪含量的影響，將可能解釋高強度運動中骨骼肌脂肪酸氧化供能比例降低的可能機制，以及為訓練負荷評定和運動促進健康研究提供分子機制。然而，我們認識到本研究數(shù)據(jù)來源于體外細胞培養(yǎng)，由于體外肌管細胞與體內(nèi)骨骼肌組織整體系統(tǒng)尚存在差異，并且受限于 EPS誘導肌管細胞收縮并不能完全模擬神經(jīng)支配肌細胞收縮等原因，因此，利用體外實驗所得的實驗結(jié)果并不一定能真實地反映體內(nèi)骨骼肌組織中 TG堆積的確切機制，尚需更多在體研究數(shù)據(jù)的進一步支持。

4 研究結(jié)論

長時間的 EPS能夠誘導肌細胞收縮，增加乳酸和 TG含量。乳酸作為信號分子物質(zhì)，通過結(jié)合其受體GPR81降低C2C12肌管細胞肌細胞中cAMP信號通路活性來抑制脂解，從而促進 TG堆積。乳酸/GPR81信號通路參與調(diào)節(jié)EPS誘發(fā)C2C12肌管細胞收縮誘導TG堆積的過程，可能是骨骼肌細胞收縮誘導能源物質(zhì)脂滴增加的分子機制之一。