徐宵宵 黎榮 陳健,△

(1.桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣西 桂林 541004；2.廣西腫瘤免疫與微環(huán)境調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541004)

胰腺癌是一種快速侵襲性和高度轉(zhuǎn)移性的癌癥，對(duì)大多數(shù)的臨床化療藥物已產(chǎn)生了耐藥性[1]。因此，開發(fā)高效價(jià)和低毒性的替代藥物是抗胰腺癌的研究新重點(diǎn)。白藜蘆醇是一種多酚植物抗毒素，存在于葡萄、漿果、花生和葡萄酒中，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡和抗癌等藥理活性[2]。白藜蘆醇對(duì)治療癌癥有良好的療效，是預(yù)防和治療胰腺癌的潛在候選化合物[3]。實(shí)驗(yàn)證明，白藜蘆醇血漿滯留時(shí)間較長，能更好地發(fā)揮藥物的治療效果，安全且耐受良好[4]。真核拓?fù)洚悩?gòu)酶II是白藜蘆醇的分子靶點(diǎn)之一，它是染色體分離和DNA超螺旋內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定所必需的酶[5]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)快速發(fā)展的基礎(chǔ)上提出的藥物設(shè)計(jì)新方法和新策略，它基于“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)，通過分析基因網(wǎng)絡(luò)庫、蛋白網(wǎng)絡(luò)庫、疾病網(wǎng)絡(luò)庫、藥物網(wǎng)絡(luò)庫等現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫的信息資料，結(jié)合從實(shí)驗(yàn)中獲得的譜圖數(shù)據(jù)，利用專業(yè)網(wǎng)絡(luò)分析軟件及算法，系統(tǒng)的、整體的揭示疾病-疾病、疾病表型-靶點(diǎn)蛋白、靶點(diǎn)蛋白-藥物、藥物-藥物之間的聯(lián)系[6]，因而為中藥成分-靶點(diǎn)-疾病-機(jī)制的研究提供了新的方法。

目前，對(duì)白藜蘆醇治療胰腺癌的作用靶點(diǎn)及其分子機(jī)制研究較少，為進(jìn)一步挖掘和整合，本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病-通路”相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測白藜蘆醇治療胰腺癌的作用靶點(diǎn)及其可能作用機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供參考性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

首先，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)制定本課題的研究思路流程圖，如圖1。

1.2 白藜蘆醇抗胰腺癌作用靶點(diǎn)的獲取

運(yùn)用Superpred數(shù)據(jù)庫獲得白藜蘆醇已驗(yàn)證靶點(diǎn)和預(yù)測靶點(diǎn)，通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫找到白藜蘆醇的預(yù)測靶點(diǎn)；應(yīng)用DisGeNET數(shù)據(jù)庫查找胰腺癌相關(guān)作用靶點(diǎn)。最后，將各個(gè)數(shù)據(jù)庫白藜蘆醇靶點(diǎn)與胰腺癌相關(guān)靶點(diǎn)相映射，獲得白藜蘆醇治療胰腺癌作用的靶點(diǎn)。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫將靶點(diǎn)蛋白名稱轉(zhuǎn)換成相對(duì)應(yīng)的基因名稱并去除非人源的靶點(diǎn)基因名稱，為后期蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的拓?fù)浞治鲎鰷?zhǔn)備。

圖1 研究思路設(shè)計(jì)流程圖

1.3 白藜蘆醇-靶點(diǎn)-胰腺癌PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與拓?fù)浞治?/h3>

將映射后獲得的白藜蘆醇抗胰腺癌作用靶點(diǎn)在STRING數(shù)據(jù)庫中獲得靶點(diǎn)-靶點(diǎn)功能相關(guān)蛋白間的作用，設(shè)置置信度得分>0.9的蛋白相互作用，剔除重復(fù)項(xiàng)；并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape_v3.2.1構(gòu)建白藜蘆醇-靶點(diǎn)-胰腺癌PPI網(wǎng)絡(luò)；運(yùn)用Cytoscape_v3.2.1中Network-Analyzer分析白藜蘆醇-靶點(diǎn)-胰腺癌PPI網(wǎng)絡(luò)中平均自由度和最大自由度等拓?fù)鋮?shù)，并根據(jù)Degree值篩選核心靶點(diǎn)，篩選范圍上限為拓?fù)鋽?shù)據(jù)中的最大Degree值，下限為平均自由度的兩倍。

1.4 核心靶點(diǎn)生物功能和通路富集分析

應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫獲得核心靶點(diǎn)生物功能和通路富集結(jié)果，整理導(dǎo)入Omicshare云平臺(tái)對(duì)白藜蘆醇抗胰腺癌核心靶點(diǎn)可能調(diào)節(jié)的生物過程及涉及的信號(hào)通路進(jìn)行可視化，并根據(jù)Pvalue繪制生物過程和信號(hào)通路高級(jí)氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 靶點(diǎn)信息

本文通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫共收集到1868個(gè)基因作為本次研究疾病靶點(diǎn)。通過SuperPred webserver數(shù)據(jù)庫檢索到白藜蘆醇的171個(gè)驗(yàn)證靶點(diǎn)，20個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)，并通過Swiss Target Predictio數(shù)據(jù)庫檢索到15個(gè)res作用靶點(diǎn)。去除掉重復(fù)的30個(gè)靶點(diǎn)，共有176個(gè)白藜蘆醇的相關(guān)靶點(diǎn)。映射后得到64個(gè)交集靶點(diǎn)。

2.2 白藜蘆醇抗胰腺癌靶點(diǎn)及功能相關(guān)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫收集這64個(gè)靶點(diǎn)功能相關(guān)的蛋白-蛋白相互作用數(shù)據(jù)，選取置信度得分大于0.9的數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Cytoscape-v3.2.1中，構(gòu)建白藜蘆醇抗胰腺癌靶點(diǎn)及功能相關(guān)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示，網(wǎng)絡(luò)有64個(gè)節(jié)點(diǎn)，由552條邊相互作用與關(guān)聯(lián)。

圖2 映射后的核心靶點(diǎn)集合

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析及核心靶點(diǎn)篩選

應(yīng)用Network-Analyzer分析白藜蘆醇抗胰腺癌靶點(diǎn)及功能相關(guān)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)表，最短路徑長度越小，介數(shù)值越大說明蛋白越重要。通過計(jì)算得自由度的中位數(shù)為17.25，最大自由度為45，因此將核心靶點(diǎn)篩選條件范圍設(shè)為34.5～45，最終獲得7個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白，分別為TP53、EGFR、PTGS2、AKT1、MAPK3、MYC以及ALB，見圖3。

圖3 預(yù)測后的核心關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)

2.4 核心靶點(diǎn)的生物功能和通路富集分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫及omicshare云平臺(tái)可視化分析，Top 20生物功能富集分析結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明，核心靶點(diǎn)的生物過程主要涉及平滑肌細(xì)胞增值正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)、細(xì)胞凋亡過程的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞對(duì)DNA損傷刺激的反應(yīng)、血管收縮的正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)表皮生長因子刺激的反應(yīng)、一氧化氮生物合成的正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)紫外線的反應(yīng)、RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細(xì)胞增殖、細(xì)胞對(duì)藥物反應(yīng)、磷脂酰肌醇3激酶信號(hào)通路的調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、蛋白磷酸化的正調(diào)控、對(duì)紫外線的反應(yīng)、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸的正調(diào)控、MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)、排卵、細(xì)胞凋亡過程的正調(diào)控等。這些生物過程多與炎癥、DNA損傷修復(fù)、氧化應(yīng)激等的發(fā)生發(fā)展密不可分，表明白藜蘆醇可能是通過調(diào)節(jié)以上生物過程發(fā)揮其抗胰腺癌作用。

通過DAVID數(shù)據(jù)庫及omicshare云平臺(tái)可視化分析，Top 20信號(hào)通路富集分析結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，核心靶點(diǎn)的KEGG通路主要涉及于宮內(nèi)膜癌通路、中心碳代謝在癌癥中的通路、癌癥通路、膀胱癌通路、蛋白聚糖在癌癥的通路、非小細(xì)胞肺癌通路、結(jié)腸直腸癌通路、神經(jīng)膠質(zhì)通路、胰腺癌通路、MAPK信號(hào)通路、黑素瘤通路、小細(xì)胞肺癌通路、ErbB信號(hào)通路、前列腺癌通路、P13K-Akt信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、丙型肝炎通路、乙型肝炎通路、甲狀腺癌通路。

圖4 與核心靶點(diǎn)相關(guān)的top 20生物學(xué)過程和信號(hào)通路

3 討論

胰腺癌是一種起病隱匿的高致死性疾病。大多數(shù)胰腺癌患者在病情發(fā)展到晚期才出現(xiàn)癥狀。大多數(shù)胰腺癌發(fā)生于胰腺導(dǎo)管內(nèi)微小的非侵襲性上皮增生，即胰腺上皮內(nèi)瘤變，并且胰腺癌細(xì)胞有廣泛的代謝重編程，使胰腺癌的治療難度大幅度增強(qiáng)[7]。研究表明，胰腺癌有四個(gè)主要的驅(qū)動(dòng)基因：KRAS、CDKN2A、TP53和SMAD4[8]。白藜蘆醇的抗氧化和抗炎作用突出，能夠保護(hù)胰腺，在糖尿病小鼠試驗(yàn)中作用顯著[9]。同時(shí)有研究表明，白藜蘆醇抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖[10]，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯。借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)白藜蘆醇抗胰腺癌的作用機(jī)制進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)其多靶點(diǎn)、多通路作用特點(diǎn)。

為了找到白藜蘆醇治療胰腺癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)，本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘到了176個(gè)白藜蘆醇作用靶點(diǎn)以及1868個(gè)胰腺癌作用靶點(diǎn)，映射后獲得64個(gè)白藜蘆醇治療胰腺癌作用靶點(diǎn)，然后在STRING數(shù)據(jù)庫獲得白藜蘆醇治療胰腺癌作用靶點(diǎn)及功能相關(guān)蛋白相互作用，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)過篩選獲得7個(gè)核心靶點(diǎn)，分別為TP53、EGFR、PTGS2、AKT1、MAPK3、MYC和ALB。TP53是非常重要的抑癌基因，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和增殖的作用。免疫化學(xué)染色顯示，TP53突變的胰腺導(dǎo)管腺癌組織中WISP1蛋白水平的上調(diào)更為顯著[11]。白藜蘆醇抗腫瘤的分子機(jī)制與抑制表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)信號(hào)有關(guān)。蛋白激酶B/AKT有三種亞型AKT1-3，由于其在各種癌癥中的本構(gòu)激活，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和增殖方面發(fā)揮著中心作用，其中AKT1過表達(dá)是高血糖觸發(fā)因素[12]。免疫組化和免疫熒光結(jié)果顯示，DKK4與MAPK3，VAV3在胰腺癌組織中共表達(dá)，推測其與MAPK信號(hào)通路激活有關(guān)[13]。MYC結(jié)合在小鼠腫瘤細(xì)胞的神經(jīng)內(nèi)分泌基因中富集，促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌導(dǎo)管-神經(jīng)內(nèi)分泌譜系的可塑性，導(dǎo)致生存和化療耐受性差。CRP/Alb比值可能是胰腺癌炎癥預(yù)后的一個(gè)重要且有前途的評(píng)分指標(biāo)[14]。根據(jù)文獻(xiàn)分析，我們可以推測白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞內(nèi)的預(yù)測靶點(diǎn)表達(dá)，發(fā)揮有效的抗癌作用。同時(shí)，這些預(yù)測靶點(diǎn)可作為潛在的抗胰腺癌分子標(biāo)記物。此外，通過靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO注釋分析和KEGG通路分析，結(jié)果顯示大多富集生物學(xué)信息與癌癥通路相關(guān)。因此，白藜蘆醇抗胰腺癌藥理活性可能是直接通過抑制這些癌癥相關(guān)通路有關(guān)。

綜上所述，白藜蘆醇抗胰腺癌的藥理機(jī)制可能與調(diào)控細(xì)胞調(diào)控及癌癥相關(guān)通路密切相關(guān)，表明基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)手段預(yù)測藥物藥效及分子機(jī)制具有一定的準(zhǔn)確性和實(shí)用性，為進(jìn)一步探討白藜蘆醇抗胰腺癌的藥理靶點(diǎn)及分子機(jī)制奠定了良好基礎(chǔ)。