安 童 張小奕 李紅霞 滿 永 竇 琳 黃秀清 唐蔚青

動脈內(nèi)膜下巨噬細胞大量吞噬修飾的低密度脂蛋白而形成富含膽固醇酯的泡沫細胞是動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的關鍵步驟[1]。巨噬細胞膽固醇反向轉(zhuǎn)運即巨噬細胞通過其表面轉(zhuǎn)運蛋白將膽固醇流出到細胞外的接受體并轉(zhuǎn)運回肝臟進行代謝的過程，已被認為具有抗動脈粥樣硬化的作用[2]；而巨噬細胞膽固醇流出是巨噬細胞膽固醇反轉(zhuǎn)運的第一步也是關鍵步驟[3-5]。因此促進巨噬細胞膽固醇流出對動脈粥樣硬化的防治具有十分重要的意義。

G蛋白偶聯(lián)受體120（G protein-coupled receptor 120，GPR120）是具有7次跨膜保守結構的視紫紅質(zhì)家族受體，長鏈脂肪酸是其天然配體，化合物GW9508也可以激活GPR120。激活的GPR120可拮抗細菌脂多糖和腫瘤壞死因子等誘導的巨噬細胞炎癥，促進巨噬細胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化[6-7]。然而，GPR120在巨噬細胞膽固醇代謝中的作用未見報道，本文以GW9508激活RAW264.7巨噬細胞GPR120，研究其在膽固醇流出中的作用及可能的機制。

材料與方法

1.材料 RAW264.7小鼠單核巨噬細胞株購自中國醫(yī)學科學院細胞庫；GW9508購自美國Cayman公司；載脂蛋白（apolipoprotein，apo）A1、高密度脂蛋白（high density lipoproteins，HDL）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自美國sigma公司；NBD-膽固醇（22-（N-（7-Nitrobenz-2-Oxa-1，3-Diazol-4-yl）Amino）-23，24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol）、Trizol購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、MTS購自Promega公司；2xSYBR購自日本Takara公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo公司；PCR引物由北京賽百盛生物公司合成；兔抗人ATP結合盒轉(zhuǎn)運體（ATP-binding cassette，ABC）A1和G1和B族清道夫受體1（Scavenger receptor class B type 1，SR-B1）單克隆抗體購自美國NOVUS公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔和羊抗鼠IgG相關抗原抗體購自北京中杉金橋生物公司。

2.方法 （1）RAW264.7細胞在含10%FBS、青霉素（105U/L）、鏈霉素（105U/L）的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（2）將RAW264.7細胞接種于6孔板中培養(yǎng)；換含0.2%BSA的DMEM培養(yǎng)基，負載2μg/mL熒光標記的膽固醇（NBD-TC）24 h；經(jīng)含0.2%BSA的DMEM培養(yǎng)基平衡細胞12 h后；用50～200μmol/L的GW9508處理細胞18 h；換無酚紅的DMEM培養(yǎng)基（含15μg/mL apo-A1和35μg/mL HDL）孵育細胞5h；收集培養(yǎng)基，同時用1N的氫氧化鈉破碎細胞；使用熒光酶標儀（激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長535nm）分別測量培養(yǎng)基及細胞的熒光強度。膽固醇流出率為：培養(yǎng)基的熒光強度/（培養(yǎng)基的熒光強度+細胞內(nèi)的熒光強度）×100%。

（3）將RAW264.7細胞接種于96孔板中培養(yǎng)；用50～200μmol/L的GW9508處理細胞18h；每孔加入40μL的MTS試劑，培養(yǎng)箱孵育4 h；于酶標儀490nm處讀取各孔吸光值；以空白對照組吸光度值為基準，計算細胞存活率。

（4）50～200μmol/L的GW9508處理RAW264.7細胞18h，用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。將25μg蛋白經(jīng)8%的SDS-PAGE凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。于含5%脫脂牛奶的TBST中室溫封閉2 h；用相應抗體（ABCA1、ABCG1、SR-B1、β-actin）于4℃孵育24 h后，TBST洗膜；用與一抗相應的辣根過氧化物酶標記的二抗于室溫孵育PVDF膜2 h；TBST洗膜后用ECL化學發(fā)光法檢測，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

（5）100和200μmol/L的GW9508處理RAW264.7細胞18h，用Trizol提取總RNA；經(jīng)DNA酶處理后，將2μg的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。定量PCR反應體系為20μL，含0.2 ng的cDNA，5 pmol/L引物，和10μL 2xSYBR。定量PCR反應條件為：50℃，2 min；95℃，10 min；95℃，15 s；60℃，1 min，循環(huán)40次。引物序列見表1。

3.統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)+標準差表示，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 檢測基因的引物序列

結 果

1.GPR120激動劑GW9508促進RAW264.7細胞的NBD-膽固醇流出 為了觀察GPR120激活是否能夠促進巨噬細胞膽固醇流出，我們用50～200 μmol/L的GPR120激動劑GW9508處理負載NBDTC的RAW264.7細胞，經(jīng)分析NBD-TC的流出率后發(fā)現(xiàn)：與對照組（0μmol/L GW9508）相比，100、150和200μmol/L的GW9508均可以促進NBD-TC向細胞外apo-A1和HDL-C的流出，且呈劑量依賴性；NBDTC流出率分別增加了8%、10%及18%（圖1）。

圖1 50-200μmol/L的GW9508對RAW264.7細胞膽固醇流出的影響（n=4）注：與 對 照 組（0μmol/L）相 比，*P＜0.05；**P＜0.01

2.50～200μmol/L的GW9508均不影響RAW264.7細胞的存活率 為了檢測50～200 μmol/L的GW9508是否具有細胞毒性，我們用GW9508處理RAW264.7細胞18h后，用MTS方法檢測了細胞存活率，發(fā)現(xiàn)與對照組（0μmol/L GW9508）相比，50、100、150和200μmol/L的GW9508均不改變細胞的存活率（圖2）。因此，50、100、150和200μmol/L的GW9508均無細胞毒性。

圖2 GW9508對RAW264.7細胞存活率的影響（n=5）

3.GPR120激動劑GW9508提高RAW264.7細胞ABCA1、ABCG1的表達 ABCA1、ABCG1和SRB1是巨噬細胞膽固醇流出的主要轉(zhuǎn)運體。為了探討GPR120是如何促進RAW264.7細胞膽固醇流出的，我們用100及200μmol/L的GW9508處理細胞18h后，定量PCR方法檢測了細胞ABCA1、ABCG1和SR-B1的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)與對照組（0μmol/L GW9508）相比，100及200μmol/L的GW9 508分別升高了ABCA1的mRNA水平3.6倍和6.8倍，分別升高了ABCG1的mRNA水平1.6倍和3.3倍，但沒有改變SR-B1的mRNA水平（圖3A）。

同時，我們用50～200μmol/L的GW9508處理RAW264.7細胞18h后，Western blot方法檢測了ABCA1、ABCG1和SR-B1的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)與對照組（0μmol/L GW9508）相比，GW9508可以升高ABCA1和ABCG1的蛋白表達水平且呈劑量依賴性；100、150及200μmol/L的GW9 508分別上調(diào)了ABCA1的蛋白水平1.4倍、1.8倍和4.8倍，分別上調(diào)了ABCG1的蛋白水平1.3倍，3.2倍和5.1倍。然而，50～200μmol/L的GW9508均不影響SR-B1的蛋白表達水平（圖3B～C）。

4.GPR120激動劑GW9508提高RAW264.7細胞LXRα的表達水平 肝X受體（Liver X receptors，LXRs）和過氧化體增殖物激活受體（Peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）都可以參與ABCA1和ABCG1的表達調(diào)控，為了確定是否它們在GW9508誘導的Raw264.7細胞ABCA1和ABCG1表達中也起調(diào)控作用，我們用定量PCR的方法檢測了它們的表達水平，發(fā)現(xiàn)：100和200μmol/L的GW9508均可上調(diào)Raw264.7細胞LXRα的mRNA水平，分別上調(diào)了0.6倍和1.25倍，且差異有統(tǒng)計學意義；但不影響LXRβ、PPARα和PPARγ的mRNA水平（圖4）。

圖3 GW9508對Raw264.7細胞的膽固醇轉(zhuǎn)運體ABCA1、ABCG1和SR-B1表達水平的影響（n=3） A：實時定量PCR檢測ABCA1、ABCG1和SR-B1的mRNA表達水平；B：Western blot檢測ABCA1、ABCG1和SR-B1蛋白表達水平；C：相關蛋白的統(tǒng)計結果；注：與對照組（GW9508 0μmol/L）相比，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001

圖4 GW9508對Raw264.7細胞的LXRs和PPARs的mRNA水平的影響（n=3）。注：與對照組（GW9508 0μmol/L）相比，*P＜0.05

討 論

動脈內(nèi)皮下的巨噬細胞通過細胞膜上的轉(zhuǎn)運體（ABCA1、ABCG1和SR-B1）將細胞內(nèi)過剩的膽固醇轉(zhuǎn)運到細胞外apoA1和HDL-C上，這個過程稱為膽固醇流出；它是膽固醇反向轉(zhuǎn)運的第一步，也是關鍵步驟[1，3]。在巨噬細胞，ABCA1經(jīng)水解ATP獲得能量后，將細胞內(nèi)的游離膽固醇和磷脂經(jīng)細胞膜轉(zhuǎn)運到細胞外乏脂的apoA-1上，形成新生的高密度脂蛋白（nHDL），起始了HDL的形成和巨噬細胞膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運。ABCG1的主要功能是將細胞內(nèi)的游離膽固醇轉(zhuǎn)運到細胞外成熟的HDL顆粒上[8]。另外，表達于巨噬細胞的清道夫受體SR-B1也可以介導細胞內(nèi)的膽固醇流向細胞外的HDL顆粒[9-10]。

GPR120是脂肪酸受體家族成員，在巨噬細胞中高表達。研究發(fā)現(xiàn)：與配體結合的GPR120通過激活與其偶聯(lián)的G蛋白的α亞基Gαq，介導以下生理功能：刺激腸道分泌胰高血糖素樣肽-1（Glucagonlike peptide 1，GLP-1），增強胰島β細胞分泌胰島素，提高脂肪、肝臟和骨骼肌組織對胰島素的敏感性；調(diào)節(jié)脂肪細胞分化、脂肪組織抗炎、以及棕色脂肪的能量代謝等[6，11-13]。另外，激活的GPR120也可以通過β-抑制蛋白（arrestin）2拮抗細菌脂多糖和TNFα等誘導的巨噬細胞炎癥，促進巨噬細胞由M1型向M2型的轉(zhuǎn)化[7]。在本研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)：激活RAW264.7巨噬細胞的GPR120可以促進細胞內(nèi)的膽固醇向細胞外流出，這一功能是通過上調(diào)ABCA1和ABCG1的表達而實現(xiàn)的，而與SR-B1無關。

多種因素在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平嚴密調(diào)控ABCA1和G1的表達。其中核受體家族成員LXRs及PPARs在ABCA1和G1的表達調(diào)控中其重要作用；LXR（α和β）是配體激活的核受體，LXRα高表達于巨噬細胞、肝臟和小腸等脂代謝活躍的組織器官，而LXRβ在全身廣泛表達。在巨噬細胞，激活的LXR與視黃醛X受體（retinoid X receptor，RXR）形成異源二聚體，可激活其靶基因ABCA1和G1的轉(zhuǎn)錄[14]。激活的PPARα和PPARγ也分別可與RXR結合，既能直接激活ABCA1和G1的轉(zhuǎn)錄；也能通過激活LXRα，間接上調(diào)ABCA1和G1的轉(zhuǎn)錄[15]。我們研究的發(fā)現(xiàn)：GPR120激動劑GW9508可以上調(diào)Raw264.7巨噬細胞LXRα的mRNA表達水平，但不影響LXRβ、PPARα和PPARγ的mRNA表達水平；由此說明：GPR120上調(diào)Raw264.7巨噬細胞ABCA1和ABCG1的表達可能是通過激活LXRα來完成的。具體GPR120是如何激活LXRα的，還需要進一步的實驗進行證實。

綜上所述，我們的研究證實了：在巨噬細胞中，激活的GPR120可以通過LXRα通路上調(diào)ABCA1和ABCG1的表達，進而促進細胞內(nèi)膽固醇向細胞外apoA-1和HDL流出。本研究為動脈粥樣硬化的防治提供了新的思路。