王愷，趙海鑫，李金亮，夏晴

國家生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京100850

腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）是重要的細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物，作為能量載體為幾乎所有的細(xì)胞生命活動提供能量，同時，ATP也是一種重要的信號分子，參與細(xì)胞內(nèi)和從細(xì)胞外到細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞[1-2]。在缺氧、病原體感染引起的細(xì)胞凋亡和組織損傷情況下，ATP可由細(xì)胞釋放至胞外作為一種危險信號參與信息傳遞，并且，有報道在化療或某些物理治療時，壞死的腫瘤細(xì)胞會將胞內(nèi)ATP釋放到微環(huán)境中，引起周圍腫瘤細(xì)胞和微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的響應(yīng)[3-4]。因此，深入研究細(xì)胞對外部環(huán)境中ATP刺激的響應(yīng)，對于理解胞外ATP這一危險信號在某些組織損傷情況下的信號傳遞作用、腫瘤細(xì)胞內(nèi)部生命活動與外部環(huán)境的聯(lián)系，以及腫瘤細(xì)胞響應(yīng)微環(huán)境物質(zhì)刺激的方式具有重要意義。

細(xì)胞外ATP可通過刺激細(xì)胞膜上的嘌呤類受體P2X7分子，引起細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的改變，從而引起細(xì)胞的免疫反應(yīng)和代謝狀態(tài)改變等[3,5-6]。鈣離子是機體各種生理活動必不可少的離子，參與膜電勢維持、神經(jīng)傳導(dǎo)、能量生產(chǎn)等重要的生理生化過程。同時，鈣離子作為一種細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的第二信使，參與了細(xì)胞內(nèi)外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和信息傳遞[7]。

在本研究中，我們采用胞漿和線粒體定位鈣探針GCaMP6的腺病毒分別感染人宮頸癌細(xì)胞HeLa[8-9]，驗證感染成功率和表達(dá)情況，研究在外源ATP刺激下HeLa細(xì)胞內(nèi)部鈣離子穩(wěn)態(tài)的改變，希望為觀察細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)組分鈣離子的動態(tài)變化提供有力的工具。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌HeLa細(xì)胞系購自American Type Culture Collection（ATCC）；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰蛋白酶、雙抗（青霉素、鏈霉素）購自邁晨科技有限公司（北京）；胎牛血清、Opti-MAM培養(yǎng)基購自Gibco公司；Lab-Tek八腔室蓋玻片、ATP購自Thermo Fisher公司；Krebs-Ringer改良緩沖液（KRB）（125 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L Na3PO4，1 mmol/L MgSO4，5.5 mmol/L葡萄糖，20 mmol/L HEPES，pH7.4）為實驗室自行配制；全長線粒體鈣探針DNA來自意大利Padua大學(xué)Diego De Stefani實驗室；cyto-GCaMP6和4mt-GCaMP6鈣探針腺病毒為本實驗室構(gòu)建；P2X7受體拮抗劑A438079來自Selleck公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HeLa細(xì)胞用含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，在5%二氧化碳條件下，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 腺病毒感染

將HeLa細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用DMEM培養(yǎng)基重懸并計數(shù)，按3×104/孔的數(shù)量均勻種在Lab-Tek八腔室蓋玻片中，待細(xì)胞完全貼壁并狀態(tài)良好時，每孔更換為200μL新鮮DMEM培養(yǎng)基，加入10μL腺病毒濃縮液，置于37℃培養(yǎng)箱中，6 h后更換為新鮮培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 倒置熒光顯微鏡下觀察熒光探針表達(dá)情況

在腺病毒感染細(xì)胞24 h后，將細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡下，在波長為488 nm的激發(fā)光下觀察細(xì)胞的發(fā)光情況，從而確定腺病毒感染效率和熒光探針表達(dá)效果。

1.5 鈣離子熒光探針動態(tài)成像

將轉(zhuǎn)染熒光探針腺病毒的HeLa細(xì)胞更換培養(yǎng)基，用生理鹽水洗3次以去除原有的DMEM培養(yǎng)基，每孔加入300μL預(yù)熱的KRB，在Ultra?VIEW spinning-disc confocal microscope（Perkin Elmer）熒光成像系統(tǒng)下觀察，激發(fā)光波長488 nm，按3 s/幀的間隔連續(xù)拍攝。用Volocity軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，每組統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)n=20。

1.6 ATP刺激下細(xì)胞鈣離子動態(tài)成像

將種植于Lab-Tek八腔室蓋玻片中的待觀察細(xì)胞更換培養(yǎng)基，用生理鹽水清洗3次后每孔加入150μL預(yù)熱的KRB，于共聚焦熒光顯微鏡成像系統(tǒng)下，以3 s/幀的間隔拍攝30 s，提前用預(yù)熱的KRB稀釋ATP至目標(biāo)濃度，快速向?qū)?yīng)腔室細(xì)胞滴加150μL終濃度為10μmol/L的ATP溶液，繼續(xù)拍攝。對于需要進(jìn)行抑制劑預(yù)處理的細(xì)胞，在拍攝前1 h即更換含有10μmol/L A438079的KRB預(yù)處理，其他操作一致。用Volocity軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，每組統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)n=20。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒感染后熒光探針在相應(yīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)中得到表達(dá)

按照標(biāo)準(zhǔn)腺病毒轉(zhuǎn)染步驟進(jìn)行操作，將cyto-GCaMP6和4mt-GCaMP6這2種不同定位的鈣探針腺病毒感染HeLa細(xì)胞，24 h后在倒置顯微鏡下初步觀察，在共聚焦熒光顯微鏡下拍攝確認(rèn)。結(jié)果顯示，感染cyto-GCaMP6腺病毒后，HeLa細(xì)胞內(nèi)熒光探針GFP信號定位于胞漿，信號較強，細(xì)胞維持良好的生長狀態(tài)；感染4mt-GCaMP6腺病毒后，HeLa細(xì)胞線粒體絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有明顯的GFP信號表達(dá)，細(xì)胞生長狀態(tài)良好（圖1）。

2.2 細(xì)胞外ATP刺激HeLa細(xì)胞胞漿發(fā)生瞬時鈣瞬變

在共聚焦熒光顯微鏡下對感染了cyto-GCaMP6腺病毒的HeLa細(xì)胞進(jìn)行動態(tài)成像，我們發(fā)現(xiàn)在對細(xì)胞加入10μmol/L外源ATP刺激時，細(xì)胞內(nèi)綠色熒光信號在6 s內(nèi)發(fā)生約10倍的瞬時增強，持續(xù)約200 s后逐漸回落到基礎(chǔ)水平。這說明，HeLa細(xì)胞能夠響應(yīng)細(xì)胞外ATP的刺激，從而發(fā)生胞漿鈣離子濃度的瞬時上升即胞漿鈣瞬變[10]，這可能是HeLa細(xì)胞對細(xì)胞外ATP刺激的一種響應(yīng)機制（圖2）。

2.3 細(xì)胞外ATP的加入刺激HeLa細(xì)胞線粒體發(fā)生瞬時鈣瞬變

同上，在共聚焦熒光顯微鏡下對感染了4mt-GCaMP6腺病毒的HeLa細(xì)胞進(jìn)行動態(tài)成像，在對細(xì)胞加入10μmol/L外源ATP刺激時，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞線粒體綠色熒光信號強度在9 s左右發(fā)生大約4倍的瞬時上升即線粒體鈣瞬變，約300 s后熒光強度逐漸下降到較低水平（圖3）。已知，細(xì)胞線粒體內(nèi)鈣離子的來源主要是胞漿[11-12]，因此，此結(jié)果說明在ATP刺激下，HeLa細(xì)胞內(nèi)整體鈣離子穩(wěn)態(tài)會發(fā)生改變，線粒體會從胞漿攝入大量的鈣離子，引起線粒體內(nèi)鈣離子濃度的上調(diào)。

2.4 HeLa細(xì)胞通過細(xì)胞膜上的P2X7受體對細(xì)胞外ATP刺激進(jìn)行鈣瞬變的響應(yīng)

據(jù)報道，真核細(xì)胞細(xì)胞膜上存在核酸類物質(zhì)的受體家族分子[13]，其中P2X7受體能夠結(jié)合ATP分子，從而將刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞，引起胞內(nèi)的生理活動改變[5-6]。我們發(fā)現(xiàn)，用P2X7受體抑制劑A438079處理細(xì)胞后[14]，細(xì)胞生長狀態(tài)和熒光探針表達(dá)情況并不受影響，但是在ATP刺激下，細(xì)胞內(nèi)胞漿鈣離子濃度和線粒體鈣離子濃度的上升都受到了抑制（圖4）。這說明，細(xì)胞外ATP能夠通過HeLa細(xì)胞膜上的P2X7受體引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的改變。通過這種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，細(xì)胞能夠快速響應(yīng)外界ATP的信號刺激。

圖1 胞漿鈣探針cyto-GCaMP6（A）與線粒體鈣探針4mt-GCaMP6（B）在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)

3 討論

作為一種重要的信號分子，鈣離子對很多器官和組織細(xì)胞內(nèi)的生理活動具有關(guān)鍵的調(diào)控作用。在受到外來刺激和內(nèi)環(huán)境變化刺激時，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度會發(fā)生波動，從而引起細(xì)胞內(nèi)生理活動狀態(tài)的改變。已知細(xì)胞內(nèi)主要的鈣離子庫是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子可以通過釋放到胞漿從而被線粒體攝取，引起線粒體活性的變化，這對于線粒體能量代謝、形態(tài)維持、氧化狀態(tài)的調(diào)節(jié)具有重要意義[11]。

圖2 外源ATP刺激引起HeLa細(xì)胞胞漿鈣離子探針熒光信號瞬時上升

圖3 外源ATP刺激引起HeLa細(xì)胞線粒體鈣離子探針熒光信號瞬時上升

圖4 ATP受體通道抑制劑A438079處理抑制外源ATP刺激引起的胞漿鈣瞬變（A）和線粒體鈣瞬變（B）

在此工作中，我們用基因編碼鈣探針對細(xì)胞內(nèi)鈣離子進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞可以對細(xì)胞外ATP刺激產(chǎn)生快速反應(yīng)，發(fā)生瞬時的胞漿鈣瞬變和線粒體鈣瞬變。這說明，HeLa細(xì)胞可以通過改變細(xì)胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)對外界環(huán)境的ATP變化產(chǎn)生靈敏的反應(yīng)，而這種能力是通過細(xì)胞膜上的P2X7受體介導(dǎo)的。研究表明在某些劇烈的細(xì)胞損傷條件例如放化療刺激下，死亡的腫瘤細(xì)胞會向外環(huán)境釋放出內(nèi)容物，這些細(xì)胞內(nèi)大量的ATP等核酸類物質(zhì)也會出現(xiàn)在外環(huán)境中，被周圍的其他細(xì)胞所感應(yīng)到，在病原體感染、組織損傷中，ATP作為危險信號，也介導(dǎo)了細(xì)胞炎癥性損傷應(yīng)答[2-4,15]。本研究成功構(gòu)建了能在活體細(xì)胞內(nèi)通過熒光探針實時監(jiān)測鈣離子響應(yīng)胞外ATP刺激的細(xì)胞實驗體系，為進(jìn)一步深入探究ATP等危險信號導(dǎo)致細(xì)胞的炎性損傷機制奠定了基礎(chǔ)。