李素芬，郝西琳，王唯斯，嚴(yán)長寶，趙妤，余敏，熊偉

1.大理大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理671000；2.大理白族自治州第一人民醫(yī)院 病理科，云南 大理671000；3.云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明530061

線粒體是所有真核細(xì)胞的“動力工廠”，其主要功能是通過氧化磷酸化為細(xì)胞提供ATP，同時也參與物質(zhì)代謝、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老等過程[1]。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體呼吸鏈功能缺陷能夠累及機體的能量代謝、神經(jīng)傳遞、內(nèi)環(huán)境平衡等，進而促進人類多種疾病的發(fā)生，如線粒體腦肌病、線粒體糖尿病、Leber遺傳性視神經(jīng)病變、耳聾、心肌病、惡性腫瘤及衰老等，統(tǒng)稱為線粒體相關(guān)疾病[2]。研究線粒體呼吸鏈缺陷發(fā)生的分子遺傳機制，可以進一步闡明線粒體相關(guān)疾病的病因并為臨床治療提供指導(dǎo)[3]。為了實現(xiàn)上述目的，需要建立一個特殊的細(xì)胞模型，它不含線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA），使我們能夠?qū)⒒颊唧w細(xì)胞或生殖細(xì)胞內(nèi)的mtDNA從一個細(xì)胞環(huán)境轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞環(huán)境，或者將新的外源DNA引入線粒體，從而闡明線粒體基因突變或缺失在呼吸鏈功能缺陷中的作用及分子機制[4]。通常，人們將mtDNA缺失的細(xì)胞系稱為Rho0（ρ0）細(xì)胞系。我們以穩(wěn)定傳代的人肺腺癌A549細(xì)胞系為母本細(xì)胞，用低劑量溴化乙錠（ethidium bro?mide，EB）持續(xù)處理該細(xì)胞系，誘導(dǎo)mtDNA缺失，試圖建立ρ0A549細(xì)胞系。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌A549細(xì)胞系由瑞典卡羅琳斯卡醫(yī)學(xué)院實驗醫(yī)學(xué)系A(chǔ)nna Karlsson教授惠贈。

RPMI1640培養(yǎng)基、透析/普通胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；EB、丙酮酸鈉、尿嘧啶核苷、苯甲基磺酰氟（phenylmethane sulfonyfluoride，PMSF）等生化試劑購自Sigma公司；動物細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒購自Qiagen公司；細(xì)胞裂解液、聚丙烯酰胺（PAGE）預(yù)制凝膠、4×蛋白質(zhì)上樣緩沖液購自Invitrogen公司；MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自Roche公司；TaqMan Real-time PCR Mas?ter Mixes購自Thermo Fisher公司；增強型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購自Millipore公司；二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白質(zhì)定量試劑盒購自Pierce公司；兔抗MT-COX1單抗（ab203912）、兔抗MT-ATP6多抗（ab192423）、兔抗SDHA單抗（ab137040）、兔抗ATP5A單 抗（ab176569）、兔 抗GAPDH單 抗（ab181602）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（ab6721）購自Abcam公司；qPCR引物和探針由昆明碩擎生物科技有限公司合成。

生物安全柜（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；全自動高壓滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）；倒置顯微鏡（Olympus公司）；QuantStudio 7 Flex實時熒光定量PCR系統(tǒng)、全自動細(xì)胞計數(shù)儀（Life Tech公司）；CO2培養(yǎng)箱、Nanodrop ND1000核酸和蛋白質(zhì)定量儀、MK3型全自動酶標(biāo)儀（Thermo Fisher公司）；蛋白質(zhì)電泳儀、Trans-Blot Turbo蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印儀（Bio-Rad公司）；G:BOX F3化學(xué)發(fā)光及凝膠成像系統(tǒng)（Syngene公司）；BL150S型電子天平（Sartorius公司）；微量移液器（Biohit公司）。

1.2 構(gòu)建無mtDNA的ρ0A549細(xì)胞系

按照文獻報道的方法[5]，將人肺腺癌ρ+A549細(xì)胞培養(yǎng)于含50 ng/mL EB、50μg/mL尿嘧啶核苷和100μg/mL丙酮酸鈉的RPMI1640完全培養(yǎng)基（含15%透析FBS）中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d更換一次培養(yǎng)液，每周傳代2次。連續(xù)培養(yǎng)35 d后，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成含50 μg/mL尿嘧啶核苷、100μg/mL丙酮酸鈉、15%透析FBS的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 相對熒光定量PCR（qPCR）檢測mtDNA拷貝數(shù)

收集處于對數(shù)生長期的野生型ρ+A549和ρ0A549細(xì)胞，用基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)總DNA。參照文獻方法[6]，采用TaqMan探針法進行qPCR，以細(xì)胞核編碼APP基因為內(nèi)參照基因，擴增線粒體基因組D-loop區(qū)來檢測mtDNA拷貝數(shù)的變化，引物序列和探針序列見表1。實驗重復(fù)3次。

1.4 Western印跡檢測蛋白質(zhì)表達水平

收集處于對數(shù)生長期的野生型ρ+A549和ρ0A549細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，采用BCA法測定各組的蛋白質(zhì)濃度[7]。每個泳道分別加入50μg蛋白質(zhì)樣品，行12% SDS-PAGE，電泳分離后將凝膠上的蛋白質(zhì)用半干轉(zhuǎn)印法（20 V，7 min）轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；將PVDF膜用含5%脫脂奶粉的PBST于室溫封閉1 h，分別滴加一抗（1∶1000稀釋），4℃孵育過夜；用PBST洗膜3次，每次5 min，洗膜結(jié)束后滴加相應(yīng)的二抗（1∶5000稀釋），室溫孵育2 h；用PBST再次洗膜3次，每次5 min；用ECL發(fā)光液顯影并采集圖像。用Image Lab 5.2.1軟件分析各條帶累積光密度值（integral optical density，IOD），統(tǒng)計2組細(xì)胞中蛋白質(zhì)相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.5 MTT法測定細(xì)胞增殖曲線

收集處于對數(shù)生長期的野生型ρ+A549和ρ0A549細(xì)胞，其中ρ0A549細(xì)胞用含100μg/mL丙酮酸鈉、50μg/mL尿嘧啶核苷、10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。將2組細(xì)胞分別制成單細(xì)胞懸液并計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104/mL，96孔板中每孔加入100μL細(xì)胞懸液，即每孔2000個細(xì)胞，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)24、48、72、96、120 h后，每孔加入20μL MTT溶液（5 mg/mL）后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄培養(yǎng)液后，每孔加入150μL二甲基亞砜溶解結(jié)晶，于搖床上低速振蕩15 min，待結(jié)晶物充分溶解后，用酶標(biāo)儀測定各孔的D570nm值。實驗重復(fù)3次。

表1 熒光定量PCR引物和探針序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

運用SPSS 21.0和Graphpad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析和繪圖，計量資料結(jié)果以x±s表示，2組間均數(shù)比較采用獨立樣本Student'st檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ρ0A549細(xì)胞的形態(tài)學(xué)鑒定

普通倒置顯微鏡下觀察，低劑量EB誘導(dǎo)35 d后，ρ0A549細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，呈拉長枝狀，長徑與短徑比值大于5；而未經(jīng)EB誘導(dǎo)的野生型ρ+A549細(xì)胞呈多角形，長徑與短徑比值小于5（圖1）。且ρ0A549細(xì)胞生長速度明顯慢于野生型ρ+A549細(xì)胞，野生型ρ+A549細(xì)胞傳代時間為2～3 d，ρ0A549細(xì)胞傳代時間為5 d，符合腫瘤失去有氧代謝途徑后在低氧下生長的一般規(guī)律。

2.2 qPCR檢測結(jié)果

以細(xì)胞核基因組（nDNA）APP基因為內(nèi)參照，擴增mtDNA的D-loop區(qū)。qPCR結(jié)果顯 示，野 生型ρ+A549細(xì)胞中可以檢測到mtDNA的拷貝數(shù)，經(jīng)低劑量EB連續(xù)誘導(dǎo)35 d的ρ0A549細(xì)胞中已無mtDNA的存在（圖2）。

2.3 Western印跡檢測結(jié)果

圖1 倒置顯微鏡下觀察A549和ρ0 A549細(xì)胞的形態(tài)

Western印跡結(jié)果顯示，野生型ρ+A549細(xì)胞中能表達核基因編碼的線粒體蛋白SDHA和ATP5A，同時也能表達線粒體基因組編碼的蛋白MT-COXI和MT-ATP6；ρ0A549細(xì)胞中無線粒體基因組編碼的蛋白MT-COXI和MT-ATP6的表達，但核基因編碼的SDHA和ATP5A蛋白均能夠正常表達（圖3）。

2.4 細(xì)胞生長曲線

在RPMI1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)野生型ρ+A549細(xì)胞，在含有尿嘧啶和丙酮酸的RPMI1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)ρ0A549細(xì)胞，MTT法檢測2組細(xì)胞的增殖力并繪制生長曲線。結(jié)果表明，與野生型ρ+A549細(xì)胞相比，ρ0A549細(xì)胞在24、48、72、96、120 h各時間點的生長速度均明顯減慢，2組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

3 討論

人類mtDNA為雙鏈閉環(huán)DNA分子，長16 569 bp，一個細(xì)胞內(nèi)常含有多個拷貝的mtDNA分子，且野生型和突變型往往同時存在[8]。mtDNA含有37個基因，分別編碼13個呼吸鏈多肽、22個tRNA和2個rRNA，此外有1個含基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的非編碼區(qū)D-loop[8]。mtDNA與細(xì)胞癌變、腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系已成為人類癌癥研究的熱點之一。目前，在許多不同類型的實體瘤中均發(fā)現(xiàn)了mtDNA拷貝數(shù)發(fā)生改變的現(xiàn)象[9]，而且mtDNA拷貝數(shù)的改變還與臨床病理參數(shù)和腫瘤的侵襲性有關(guān)[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，在人肺腺癌A549細(xì)胞中，由于mtDNA拷貝數(shù)的減少而誘導(dǎo)的線粒體壓力引起了細(xì)胞表型的改變，顯著影響了腫瘤的增長和腫瘤的侵襲性，并且ρ0A549細(xì)胞較ρ+A549細(xì)胞的放射敏感性降低[11]。這些結(jié)果提示，mtDNA拷貝數(shù)的減少與線粒體氧化磷酸化復(fù)合物的下降密切相關(guān)，進而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)異常的能量代謝與物質(zhì)代謝。

圖2 qPCR檢測A549和ρ0 A549細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)

圖3 Western印跡檢測ρ0 A549細(xì)胞核編碼蛋白質(zhì)和線粒體編碼蛋白質(zhì)

圖4 MTT檢測ρ0 A549細(xì)胞生長曲線（*P＜0.05）

已有研究表明，用低劑量EB處理腫瘤細(xì)胞可建立無mtDNA的腫瘤細(xì)胞系[12]。因為EB是一種DNA分子螯合劑，可以插入無組蛋白保護的mtDNA分子堿基內(nèi)部，并顯著抑制DNA聚合酶γ在mtDNA復(fù)制過程中的活性[13]。細(xì)胞培養(yǎng)基中低劑量的EB即可導(dǎo)致人類細(xì)胞內(nèi)的mtDNA分子完全缺失，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)存在線粒體但無mtDNA。mtDNA的缺失使線粒體基因組編碼的呼吸鏈必需的蛋白質(zhì)缺失而導(dǎo)致呼吸鏈功能受損，細(xì)胞只能通過ATP/ADP轉(zhuǎn)位酶、糖酵解途徑產(chǎn)生的能量來維持生長需要。同時，由于線粒體電子鏈完整性受到破壞，波及到參與嘧啶合成的二氫乳氫酸脫氫酶活性，影響嘧啶核苷酸的生物合成，因而加入外源性的尿嘧啶核苷是無mtDNA的人類細(xì)胞系生長所必需的[14]。我們在本研究中發(fā)現(xiàn)，以100 ng/mL EB誘導(dǎo)培養(yǎng)人肺腺癌A549細(xì)胞，能夠進行性降低細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)。研究中還發(fā)現(xiàn)，如果誘導(dǎo)7 d后撤除EB，mtDNA拷貝數(shù)會逐漸恢復(fù)。用EB連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)35 d的ρ0A549細(xì)胞則能逐漸形成較低水平的mtDNA拷貝數(shù)直到mtDNA完全缺失。這些結(jié)果強烈提示，EB誘導(dǎo)的人肺腺癌A549細(xì)胞內(nèi)mtDNA缺失是一個長期積累的過程。PCR法是鑒定mtDNA缺失的常規(guī)方法之一，本研究通過qPCR檢測mtDNA擴增情況和mtDNA拷貝數(shù)，證實ρ0A549細(xì)胞中mtDNA的缺失。同時，Western印跡也表明，ρ0A549細(xì)胞不能表達線粒體基因組編碼的蛋白質(zhì)，但是能夠正常表達核基因編碼的線粒體蛋白質(zhì)。以上結(jié)果從分子水平上證實無mtDNA的ρ0A549細(xì)胞系已經(jīng)構(gòu)建成功。MTT細(xì)胞增殖實驗結(jié)果表明，與野生型ρ+A549細(xì)胞相比，ρ0A549細(xì)胞在不同時間點的生長速度均明顯減慢，提示ρ0A549細(xì)胞已無法通過線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，而主要依靠糖酵解來供能維持細(xì)胞生長。

mtDNA突變與人肺腺癌發(fā)生關(guān)系密切[15-16]。由于ρ0A549細(xì)胞中缺乏內(nèi)源mtDNA，可以通過細(xì)胞融合技術(shù)構(gòu)建各種胞質(zhì)雜交融合細(xì)胞（cy?brid），建立肺腺癌線粒體基因突變模型，并且有效排除核基因的干擾。在后續(xù)研究中，我們將進一步構(gòu)建轉(zhuǎn)線粒體細(xì)胞系，研究相同核遺傳背景下，不同mtDNA分子的基因突變及功能變化，為人肺腺癌發(fā)生和mtDNA突變的相關(guān)性研究奠定基礎(chǔ)。

志謝：衷心感謝瑞典卡羅琳斯卡醫(yī)學(xué)院實驗醫(yī)學(xué)系周小山研究員、趙茜博士提供的實驗技術(shù)指導(dǎo)和對文稿寫作的建議。