武瑾，趙鵬，姜棋予，馬燕，張木子荷，王威，李樹，郭妤姝

1.解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心 藥劑科，北京100048；2.內蒙古軍區(qū)衛(wèi)生防疫隊，內蒙古 呼和浩特010051；3.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心 臨床研究管理中心，北京100039；4.解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心 消化內科，北京100039；5.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心 藥學部，北京100039

乳腺癌是嚴重危害我國女性健康的惡性腫瘤，其患病率占所有惡性腫瘤的7%～10%[1]。根據(jù)雌激素受體（estrogen recptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長因子受體2（human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2）等的表達，乳腺癌可分為內分泌依賴型、HER2陽性型及三陰性乳腺癌[2]。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）約占所有乳腺癌類型的15%～20%，發(fā)病率較高，具有進展快、侵襲能力強、易發(fā)生局部復發(fā)和遠處多發(fā)轉移的特點，患者的生存期及預后較差[3-4]。近幾年針對ER和HER2靶點的抗乳腺癌小分子藥物和抗體相繼投入臨床使用，顯示了一定的乳腺癌治療效果，例如他莫昔芬、氟維司群、曲妥珠單抗等[4-5]。然而三陰性乳腺癌目前治療策略選擇較少，亟需能夠治療三陰性乳腺癌的藥物和方法。瑞戈非尼（regorafenib）是拜耳公司研發(fā)的口服多靶點酪氨酸激酶抑制劑，能夠抑制血管生成、抑制腫瘤細胞增殖并調控腫瘤微環(huán)境，從而達到抑制腫瘤增殖與侵襲的目的[6]。目前美國食品藥品管理局（FDA）已批準用于結直腸癌、胃腸道間質瘤及肝癌的治療[7]。瑞戈非尼是否能夠抑制三陰性乳腺癌目前尚無研究報道。本研究中，我們采用三陰性乳腺癌細胞的裸鼠皮下腫瘤模型和肝臟原位轉移模型，探討瑞戈非尼是否對三陰性乳腺癌具有抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級免疫缺陷小鼠（BALB/c品系的胸腺缺失小鼠）購自北京市斯貝福生物科技有限公司；吸入麻醉劑異氟烷購自深圳沃瑞德公司；小動物實驗相關手術器械為本實驗室提供。實驗動物飼養(yǎng)及動物手術于解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心臨床研究管理中心實驗動物中心開展。飼養(yǎng)條件為溫度22～23℃，環(huán)境濕度50%，自由進食和飲水，按3R原則給予人道關懷。

MDA-MB-231細胞系（高侵襲性三陰性乳腺癌細胞）[8]由解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心馮帆博士惠賜，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)（均為Invitrogen公司產品）；分子實驗RNA提取試劑盒購自Qiagen公司；qPCR一步法擴增試劑盒購自KAPA公司；ABI 7500 Real-Time PCR儀為本實驗室提供；肝臟腫瘤多發(fā)與彌散病灶照片的定量分析采用Image J軟件（版本號1.51j8），由美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）發(fā)布。

1.2 免疫缺陷裸鼠皮下成瘤實驗

在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)MDA-MB-231細胞，生長至80%密度時收集細胞并計數(shù)，用滅菌生理鹽水重懸，備用。于5～6周齡BALB/c免疫缺陷小鼠雙側后肢內側皮下注射上述MDA-MB-231細胞懸液，每個后肢注射細胞量為1×106，接種3 d后對小鼠進行灌胃給藥，瑞戈非尼組給予2 mg/kg瑞戈非尼，對照組給予PBS溶劑對照，隔日固定時間給藥。持續(xù)給藥3周后處死動物，解剖小鼠下肢獲得腫瘤組織，稱重，測量腫瘤組織的長度與寬度，按照公式（腫瘤體積=腫瘤長度×腫瘤寬度×腫瘤寬度/2）估算腫瘤體積，并以腫瘤體積和腫瘤質量計算抑制率。

1.3 免疫缺陷裸鼠肝臟腫瘤多發(fā)與彌散病灶模型的建立[9]

在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)MDA-MB-231細胞，生長至80%密度時收集細胞并計數(shù)，用滅菌生理鹽水重懸，控制細胞濃度為2.5×106/mL。用吸入麻醉劑異氟烷，麻醉機持續(xù)麻醉5～6周齡BALB/c免疫缺陷小鼠（首次麻醉濃度為3.5%，持續(xù)麻醉濃度為2.0%），并將小鼠固定。用滅菌手術器械沿腹部劍突下方按小鼠肝臟位置斜切1.5 cm開口，分離筋膜層，小心擠出肝右葉，暴露肝門靜脈，用滅菌注射器向肝門靜脈注射200μL上述MDA-MB-231細胞懸液，注入總細胞量為5×105。接種完畢，將肝臟輕柔推回腹腔內縫合，避免出血。按照1.2所述方法按瑞戈非尼組和對照組灌胃給藥，3周后處死小鼠并對肝臟組織進行PET/CT檢測。

1.4 小動物PET/CT檢測

BALB/c免疫缺陷小鼠經尾靜脈注射約200 μCi核素探針18F-FDG，30 min后收集動物血液標本，處死動物并解剖肝臟，立即對肝臟組織進行PET/CT檢測，按照18F-FDG核素掃描模式，進行12 min掃描采像[10-11]。用蓋革計數(shù)器測量肝臟和血液的核素強度，同時對肝臟組織進行拍照。

1.5 實時定量PCR（qPCR）實驗

對1.2方法獲得的皮下腫瘤研磨并提取總RNA，用一步法qPCR進行檢測。設置三重復和陰性對照，分別檢測E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白（vimentin）、基質金屬蛋白酶3（MMP-3）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、組織基質金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP-1）的基因表達情況，以GAP?DH為內參。qPCR實驗使用的引物見表1。

1.6 統(tǒng)計學分析

結果以x±SD顯示，統(tǒng)計學分析采用SPSS17.0軟件，單因素方差分析比較x±SD方法計算P值，以P＜0.05為具有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 瑞戈非尼對MDA-MB-231皮下成瘤具有抑制作用

經過3周的隔日灌胃給藥治療，瑞戈非尼組小鼠皮下腫瘤明顯小于對照組（圖1A）。圖1B為皮下腫瘤體積的定量結果，圖1C為腫瘤稱重結果，圖1D為腫瘤體積和腫瘤質量的抑制率結果，瑞戈非尼對裸鼠皮下成瘤的腫瘤質量和腫瘤體積的抑制率約為63%。這表明，服用瑞戈非尼能夠抑制三陰性乳腺癌細胞在裸鼠體內的生長。

2.2 瑞戈非尼對MDA-MB-231的裸鼠肝臟多發(fā)與彌散腫瘤病灶具有生長抑制作用

裸鼠經肝門靜脈注射5×105三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231以模擬三陰性乳腺癌肝轉移作用，接種細胞后即進行瑞戈非尼治療，經過3周生長，瑞戈非尼持續(xù)給藥能夠顯著抑制肝臟多發(fā)與彌散病灶的生長。對小鼠肝臟的PET/CT拍攝圖片與定量結果顯示（圖2A、B），瑞戈非尼組動物肝臟相對于血液的核素信號明顯低于溶劑對照組。經Image J軟件對肝臟照片進行多發(fā)于彌散病灶面積定量（圖C），瑞戈非尼組散發(fā)病灶面積顯著低于對照組。這表明，瑞戈非尼對于三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231在裸鼠肝臟原位多發(fā)于彌散腫瘤模型中具有生長明確的抑制作用，其對乳腺癌肝轉移等乳腺癌轉移作用具有臨床診療價值。

2.3 瑞戈非尼抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231增殖的分子機制

對瑞戈非尼組MDA-MB-231細胞在裸鼠皮下形成的腫瘤進行總RNA提取和qPCR實驗，檢測瑞戈非尼對MDA-MB-231細胞上皮-間質轉化和轉移、侵襲的影響。結果如圖3A、B、C，瑞戈非尼能夠升高MDA-MB-231上皮標志物E-鈣黏蛋白表達，降低間質標志物N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達，抑制MDA-MB-231的上皮-間質轉化。圖3D、E、F顯示，瑞戈非尼能夠降低MMP-3與MMP-9的表達，同時升高TIMP-1的表達，表明瑞戈非尼能夠抑制MDAMB-231的轉移和侵襲相關蛋白表達。

表1 qPCR實驗引物

3 討論

三陰性乳腺癌往往具有高侵襲性、易遠處轉移、化療后易復發(fā)等特點，導致預后較差，越來越引起人們的重視。除此之外，對于化療敏感的三陰性乳腺癌患者也僅有15%～20%，大部分患者沒有有效的治療藥物[12]，因此研究三陰性乳腺癌新型有效的治療方法顯得尤為重要。目前研究[13]表明，三陰性乳腺癌缺乏特定的分子靶點，這增加了三陰性乳腺癌藥物研發(fā)的難度。瑞戈非尼是一種多靶標蛋白激酶抑制劑，能夠通過作用于腫瘤細胞增殖、腫瘤血管生成及腫瘤微環(huán)境相關靶點，發(fā)揮多重抗腫瘤作用?？梢种频陌悬c有VEG?FR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、TIE-2、BRAF、KIT、RET、PDGFR和FGFR，目前瑞戈非尼已獲批用于治療晚期結直腸癌、胃腸間質瘤和肝細胞癌。本研究結果揭示了瑞戈非尼對三陰性乳腺癌的體內生長與轉移侵襲作用具有明確的抑制作用。

圖1 瑞戈非尼抑制MDA-MB-231裸鼠皮下成瘤

圖2 瑞戈非尼抑制MDA-MB-231在肝臟原位生長

圖3 瑞戈非尼抑制MDA-MB-231的上皮-間質轉化和轉移、侵襲

MDA-MB-231是高侵襲性的三陰性乳腺癌細胞系，也是目前相關研究最為公認和常用的模型。我們培養(yǎng)獲得MDA-MB-231細胞建立裸鼠皮下腫瘤模型以及干門靜脈注射建立裸鼠肝臟原位多發(fā)與彌散轉移模型模擬三陰性乳腺癌在體內的增殖與肝臟轉移，顯示瑞戈非尼治療對MDA-MB-231的體內生長與轉移、侵襲作用具有明確的抑制作用。初步探討了瑞戈非尼作用的分子機制。瑞戈非尼治療能顯著上調上皮標識物E-鈣黏蛋白、下調間質標識物N-鈣黏蛋白與波形蛋白的表達，表明瑞戈非能抑制MDA-MB-231的上皮-間質轉化作用。同時，瑞戈非尼治療還能下調MMP3與MMP9的表達，上調TIMP1的表達，表明瑞戈非尼能明確抑制MDAMB-231轉移和侵襲相關蛋白表達以減緩細胞的轉移與侵襲作用。上皮-間質轉化是惡性腫瘤細胞惡變、轉移/侵襲及抗腫瘤藥物耐藥的主要調節(jié)機制之一，而MMP能夠直接降解與破壞細胞外基質與基底膜，最終加速惡性腫瘤細胞轉移與侵襲作用。

綜上所述，我們通過動物實驗模型及機制實驗，初步闡明了瑞戈非尼對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231的抑制作用，不僅拓展了對新型分子靶向藥物瑞戈非尼的認識，也為三陰性乳腺癌治療提供了更多可能選擇。