鄭海雅　蘭俊　呂雷立　黃振強

[摘要] 目的 探討黃連素在大鼠腎臟缺血再灌注損傷中的作用。 方法 40只雄性SD大鼠隨機分為對照組（S組）、模型組（IR組）、黃連素組（H組）和黃連素+Exendin-（9-39）組（HE組）。S組給予生理鹽水及行假手術處理，IR組給予生理鹽水，H組給予黃連素，HE組給予黃連素+ Exendin-（9-39），三組制作大鼠腎臟缺血再灌注模型。觀察腎組織病理學改變，檢測造模前及造模12 h和24 h后血清中肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）水平及血清白細胞介素（IL）-10、血管內皮生長因子（VEGF）以及腎組織中腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-1β、IL-6的含量。本次實驗研究時間為2016年9～11月。 結果 模型制作成功，血清 BUN、Cr 水平在H組中低于IR組（P<0.05），而HE組低于H組（P<0.05）;IR組、H組、HE組中IL-10、IL-6、TNF-α、VEGF水平均高于S組（P<0.05），HE組IL-6、TNF-α水平較H組明顯降低（P<0.05）。四組IL-1β水平無明顯變化。 結論 黃連素能有效改善腎臟缺血再灌注大鼠的腎功能，其機制可能與抑制腎臟組織炎癥反應有關。

[關鍵詞] 黃連素;腎臟缺血再灌注;炎癥因子;保護作用

[中圖分類號] R692? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）02-0032-05

黃連素（berberine，BR）又稱小檗堿，是從黃連、黃柏等中藥中發(fā)現(xiàn)的生物堿，具有抗腫瘤[1，2]、抗炎[3，4]、抗菌[3-5]、抗氧化[6]、保護心血管[7，8]等諸多的藥理作用。近年來黃連素對急性損傷的保護作用已經(jīng)引起醫(yī)學研究者的重視[9]。1985年至今，國內外開展大量有關黃連素對急性損傷保護作用的研究，證實黃連素通過減輕脂質過氧化、調節(jié)相關炎癥因子水平等方式可對急性損傷起到保護作用。黃連素在大鼠心肌缺血再灌注中進行廣泛研究[10，11]，但黃連素是否對缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）引起的腎臟損傷也具有保護效應，至今鮮有報道。本文采用大鼠缺血再灌注模型，模擬腎臟缺血再灌注損傷，觀察黃連素對損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選擇40只成年雄性SD大鼠，體重為220～240 g，2016年9月購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號為SCXK（京）2016-0011。動物飼養(yǎng)和處理均按照我院實驗動物管理規(guī)定執(zhí)行。本研究經(jīng)過我院倫理委員會批準通過。黃連素（純度98%）購于上海阿拉丁試劑有限公司，Exendin-（9-39）購于上海浩然生物技術有限公司，尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）試劑盒購于南京建成生物工程研究所，IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α、VEGF等酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術研究所。本次實驗研究時間為2016年9～11月。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組、藥物干預方法及模型制備? 40只SD大鼠用普通飼料適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為對照組（S組）、模型組（IR組）、黃連素組（H組）和黃連素+Exendin-（9-39）組（HE組），每組各10只。S組、IR組給予生理鹽水2 mL/d，連續(xù)7 d腹腔注射，S組行假手術處理，H組給予黃連素0.4 mg/（kg·d）（0.4 mg黃連素粉溶解于2 mL生理鹽水）連續(xù)7 d腹腔注射，HE組給予黃連素0.4 mg/（kg·d）（0.4 mg黃連素粉溶解于2 mL生理鹽水）腹腔注射7 d+Exendin-（9-39）45 μg/kg/3 d腹腔注射（在第1、4天注射），IR組、H組、HE組在連續(xù)注射7 d后制作大鼠腎臟缺血再灌注模型。首先對大鼠腹腔注射2%的戊巴比妥鈉（40 mg/kg）進行麻醉，大鼠以仰臥位固定至手術臺，四肢固定，用醫(yī)用酒精進行腹部消毒，從腹部正中線切口暴露左腎和右腎，分離出腎包膜及腎動靜脈，使腎蒂游離，切除右側腎，IR組、H組、HE組使用無損傷動脈夾夾閉左腎腎蒂，此時，腎臟顏色變?yōu)榘导t色說明腎臟血流被阻斷，45 min后松開動脈夾使血流恢復供應，腎臟顏色變?yōu)轷r紅色，即認為IR模型制備成功。S組在切除右腎后，僅使左側腎蒂游離，而不阻斷血流，暴露45 min后，逐層關閉腹腔。

1.2.2 血清BUN、SCr、IL-10、VEGF水平測定? 制備模型前，每組大鼠經(jīng)頸靜脈竇取血2 mL，以測大鼠血清造模前BUN、SCr、IL-10、VEGF水平，在制備模型處理或假手術處理12 h和24 h后，麻醉大鼠，經(jīng)心臟取血4 mL，每次取血后離心留取血清，依照BUN、SCr試劑盒（南京建成生物工程研究所）的操作說明，經(jīng)日本Olympus Au2700 全自動生化分析儀檢測各時間點血清BUN、SCr水平。按照ELISA實驗操作及VEGF、IL-10試劑盒（上海碧云天生物技術研究所）說明測定12 h和24 h時間點血清中VEGF、IL-10的水平。

1.2.3 腎組織學觀察及腎組織炎癥因子測定? 各組大鼠取血后，切取左側腎臟，固定采用4%多聚甲醛，制備石蠟切片，用蘇木素-伊紅（HE）染色，置于日本Olympus顯微鏡下（×200）觀察病理變化。部分剩余腎臟組織稱量，切碎，以1：10的比例加入生理鹽水，進行勻漿，在4500 r/min、4℃條件下離心15 min，取上清液，按照ELISA實驗操作及IL-6、IL-1β、TNF-α試劑盒（上海碧云天生物技術研究所）說明測定腎組織中IL-6、IL-1β、TNF-α的水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料采用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腎功能檢測結果

S組大鼠血清BUN、SCr水平在造模前、造模后12 h和24 h時間點無明顯差異，在造模成功12 h和24 h后，IR組、H組及HE組血清BUN、SCr水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），并且IR組大鼠血清BUN、SCr水平升高最為明顯。在造模成功12 h及24 h后IR組、H組及HE組血清BUN、SCr水平高于造模前及S組血清水平（P<0.05），H組及HE組BUN、SCr水平明顯比IR組低（P<0.05），造模24 h后HE組血清BUN、SCr濃度較H組低（P<0.05），見表1。

2.2 各組大鼠腎臟組織病理學變化

HE染色后，顯微鏡下（×200）可看到S組腎小球、腎小管結構完整，清晰可見，管腔無堵塞，無明顯組織形態(tài)異常。IR組腎小管可看到上皮細胞出現(xiàn)明顯腫脹、壞死，刷狀緣大量脫落，部分腎小管發(fā)生管型及管腔阻塞，有大量中性粒細胞浸潤腎間質。與IR組比較，用藥組腎小管腫脹稍輕，病變程度有所減緩，腎小管刷狀緣可見少量脫落細胞，腎小管基底膜完整性較好，腎小管中管型少見。與H組比較，HE組改善程度較好，腎小管腫脹較輕，腎間質未見明顯中性粒細胞，腎小管刷狀緣未見明顯脫落（封三圖1）。

2.3 ELISA檢測IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10結果

IL-6、IL-1β、TNF-α對腎臟缺血再灌注損傷有損害作用，IL-10對腎臟缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用，四種細胞因子在腎臟缺血再灌注損傷后均可能出現(xiàn)升高情況。結果顯示，在造模成功12 h和24 h后，IR組、H組及HE組血清IL-10含量水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），并且用藥組大鼠血清IL-10水平升高最為明顯（表2）。IR組、H組、HE組腎組織勻漿的IL-6、TNF-α水平均高于S組（P<0.05），其中IR組腎組織IL-6、TNF-α濃度最高（P<0.05）。與H組相比，HE組IL-6、TNF-α水平均明顯降低（P<0.05，表2）。IR組、H組、HE組血清中的IL-10水平均高于S組（P<0.05）。與S組比較，IR組、H組、HE組小鼠腎組織勻漿IL-1β水平無明顯變化（P>0.05）（表2）。

2.4 ELISA檢測血清VEGF結果

IR組、H組、HE組術后12 h和24 h血清VEGF的表達均高于相同時間點的S組（P<0.05）;在相同時段內，H組、HE組血清VEGF的表達低于IR組（P<0.05），見表3。

3 討論

有研究表明[12]，腎小球濾過率作用減弱與腎小球、腎小管的變化伴隨間質性炎癥有關，腎臟缺血再灌注可以通過降低微小血管的血流量、誘發(fā)內皮細胞功能紊亂、引起白細胞介導的炎癥反應，從而導致急性腎損傷。在臨床研究中，腎臟缺血再灌注損傷好發(fā)于冠脈搭橋、心臟體外大循環(huán)、腎移植等手術，可導致大量腎單位嚴重的破壞，如大量腎小管上皮細胞出現(xiàn)腫脹、受損現(xiàn)象，腎小管刷狀緣大量脫落，空泡大量變性、壞死，腎間質大量炎癥細胞浸潤等病理改變，致使腎小球濾過率急劇下降，腎小管重吸收功能減弱，引起血清BUN、SCr增高等。本研究結果顯示，IR組血清BUN、SCr濃度較S組明顯升高，顯微鏡下觀察IR組腎臟組織形態(tài)結構明顯異常，小管管腔顯著腫脹、壞死，損傷嚴重部位腎小管阻塞，刷狀緣大量脫落，腎間質出現(xiàn)充血性水腫，腎組織受到大量中性粒細胞浸潤等病理改變。這些病理特征提示IR模型建立成功。黃連素是一類常見的異喹啉類生物堿，有研究表明[13]該藥物治療消化系統(tǒng)疾病與腹瀉有著較好的療效，但是通過口服給藥吸收不理想，在體內首過效應較強，血藥濃度持續(xù)時間短，因此本研究采用腹腔注射給藥方式。Exendin-（9-39）是一種天然的胰高血糖素樣肽-1天然拮抗劑，有研究表明[14-16]Exendin-（9-39）可以促進胃腸蠕動，增強胃腸的吸收功能。本研究結果證實，黃連素+ Exendin-（9-39）組（HE組）、黃連素組（H組）腎臟組織病理形態(tài)結構與模型組（IR組）相比較為緩解，提示該藥物可減弱腎臟缺血再灌注損傷，緩解受損程度; 與黃連素組相比，黃連素+Exendin-（9-39）組對腎臟缺血再灌注損傷病理學變化明顯改善，提示黃連素應用時，可適當聯(lián)合應用Exendin-（9-39），可增強機體對黃連素的吸收，增加藥效，但本實驗尚缺乏對黃連素聯(lián)合Exendin-（9-39）用藥機制，聯(lián)合用藥有待進一步研究。與IR組相比，黃連素腹腔注射給藥干預大鼠能明顯降低血清BUN、SCr含量，血清BUN、SCr含量水平是腎臟缺血再灌注損傷后發(fā)生變化的重要指標，H組、HE組BUN、SCr含量較低也表明黃連素能減輕腎臟缺血再灌注對大鼠造成的損傷，因此黃連素對IR大鼠有明顯的保護作用，但黃連素對IR大鼠有保護機制目前鮮有文獻報道[17-19]，有待進一步研究。

研究表明[20-22]，當發(fā)生缺血再灌注損傷時，涉及鈣超載、氧自由基產(chǎn)生、細胞凋亡等多種細胞反應，在此過程中會有眾多免疫因子和炎癥介質的參與，而炎癥反應參與了組織損傷的整個過程。在腎臟缺血再灌注損傷時，機體發(fā)生炎癥反應，大量釋放促炎細胞因子，血管內皮細胞和白細胞表面黏附分子表達升高、血管內皮細胞與白細胞黏附、白細胞被激活及對組織造成損傷作用[23]。在炎癥反應的過程中，巨噬細胞則發(fā)揮重要作用，它既發(fā)揮效應細胞功能，同時也發(fā)揮抗原遞呈細胞的作用。巨噬細胞被活化后，吞噬病原體并釋放多種重要的炎癥因子如IL-1、IL-6、IL-10、IL-1β和TNF-α。正常情況下，巨噬細胞駐守腎臟中的數(shù)量較少，但在腎臟缺血后即出現(xiàn)快速聚集現(xiàn)象。近年來大量研究證實[24-28]由炎癥細胞以及炎癥因子介導的相關炎癥反應在IR的發(fā)病中起重要作用，腎臟缺血再灌注時，大量巨噬細胞隨著血流灌注融入腎組織，在腎組織中分泌細胞因子，致使白細胞被激活，并匯聚中性粒細胞、誘導細胞凋亡，使炎癥反應瀑布樣激活，進一步加重腎臟損傷。在炎癥反應網(wǎng)絡中，IL-6、IL-1β、TNF-α是重要的促炎細胞因子，TNF-α通過上調血管內皮黏附因子表達，增加血管內皮細胞與中性粒細胞黏連，導致炎癥細胞滲出、遷徙，致使機體組織微循環(huán)受阻，造成損傷;IL-6和IL-1β可促進粒細胞介導的炎癥反應以及中性粒細胞激活，進而加重腎臟損傷程度。而IL-10對腎臟缺血再灌注損傷主要發(fā)揮保護作用。因此，研究TNF-α、IL-6、IL-10和IL-1β等炎癥因子表達水平對大鼠腎臟缺血再灌注損傷機制具有重要的作用[29]。本課題研究顯示，與S組比較，IR組、H組、HE組血清炎癥因子IL-10及腎組織IL-6、TNF-α水平均明顯升高，表明在大鼠腎臟缺血再灌注導致的腎組織損傷中，機體炎癥反應被激活，抑炎因子和促炎因子水平均升高。此外，本研究結果顯示用黃連素對大鼠進行腹腔注射處理可明顯降低腎臟缺血再灌注損傷中促炎細胞因子IL-6、TNF-α水平，提高抑炎細胞因子IL-10水平，表明黃連素預處理減輕腎臟缺血再灌注損傷可能與抑制炎癥反應相關。與H組相比，HE組IL-6、TNF-α水平均明顯降低，因此可認為黃連素對細胞因子IL-6、TNF-α水平的分泌作用可能有劑量依賴關系，但S組、IR組、H組、HE組小鼠腎組織勻漿IL-1β水平無明顯變化，可以認為黃連素與細胞因子IL-1β水平的分泌作用可能不相關。但黃連素在腎臟再灌注損傷抑制炎癥的具體機制不清，有待進一步研究。

大鼠缺血再灌注損傷后，有多種細胞因子參與機體病理生理反應，除炎癥因子IL-6、TNF-α等參與外，血管內皮生長因子也是重要的一種[30，31]。VEGF是一種促內皮細胞分裂素，其主要作用為促進內皮細胞分裂，增殖血管內皮細胞，從而促進血管新生，新生血管數(shù)目和血管密度與VEGF密切相關。血管新生中重要環(huán)節(jié)的發(fā)生，如血管形成、細胞移行、內膜修復并維持其完整性等，均受VEGF影響。本次實驗研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腎臟缺血再灌注損傷后，血清中VEGF明顯升高，因此，VEGF對腎臟缺血再灌注損傷的診斷和治療有一定的參考價值;用黃連素對大鼠進行腹腔注射處理可明顯降低腎臟缺血再灌注損傷中VEGF表達水平，表明黃連素預處理減輕腎臟缺血再灌注損傷還可能與降低VEGF的表達相關。由于VEGF表達的相關信號通路較為復雜，因此黃連素預處理在腎臟缺血再灌注損傷中降低VEGF表達的具體機制尚不明確，有待深入研究。

綜上所述，黃連素后處理可減輕腎臟IR損傷，改善腎臟功能、減緩腎組織的損傷程度，抑制炎癥應激反應可能是其作用機制之一，但由于腎臟IR損傷發(fā)生機制、該藥物的作用機制的復雜性，黃連素保護作用與腎臟IR損傷的確切關系有待更進一步研究。

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（收稿日期：2018-05-31）