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(溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江溫州 325027)

梔子是茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果實,作為中國傳統(tǒng)的中藥藥材,在臨床中被應(yīng)用于保肝利膽藥,歷代本草經(jīng)中亦有記載其效用。梔子性味苦寒,入心、肺、三焦經(jīng),具有清熱瀉火、利濕除煩、涼血解毒和抗氧化等功用[1-2]。梔子中含有多種化學(xué)成分,主要包括單萜、三萜(梔子花酸類)、黃酮(梔子素類)、環(huán)烯醚萜類(梔子甙類)、藏紅花素、有機(jī)酸及揮發(fā)油等等。其中梔子皂甙為梔子的主要活性物質(zhì)之一,具有消炎、鎮(zhèn)痛、瀉下、保肝、解熱等作用,在醫(yī)學(xué)上可用作抑菌劑、清熱解毒劑等,廣泛運用于醫(yī)藥研究、病理試驗等方面,有很高的藥用價值[3]。

目前，國內(nèi)外皂甙的提取方法有很多,如乙醇提取法、水提取法和樹脂吸附法等[4],但這些方法存在流程長、浪費率高以及提取率低等問題;吳亞超等[5]利用超聲波輔助提取梔子皂甙,提取梔子苷含量較藥典法高3.98%;王建輝等[6]將微波輔助萃取法應(yīng)用于絲蘭皂甙乙醇浸提中,時間縮短80%,提取率提高41.56%;賀曉龍等[7]總結(jié)了微波輔助提取百合總皂甙的優(yōu)點,即萃取效率高、提取時間短、設(shè)備簡單、溶劑消耗低和污染小等,但是都沒有系統(tǒng)闡述微波輔助提取皂甙參數(shù)模型和最佳的提取條件。本試驗綜合文獻(xiàn)資料,采用微波輔助的方法來提取梔子皂甙,以單因素實驗(微波功率、微波時間、浸提時間、浸提溫度、液固比、乙醇濃度)為基礎(chǔ),選出影響梔子皂甙得率最大的四個因素作為考察對象,采用了Box-behnken響應(yīng)面法分析梔子皂甙提取的最優(yōu)條件,提取的梔子皂甙與抗壞血酸作對比,探究梔子皂甙的抗氧化能力,旨在為開拓具抗氧化能力的天然皂甙提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梔子果實 購于溫州農(nóng)貿(mào)市場,120 ℃烘干機(jī)器粉碎過后過50目篩,得梔子粉末;薯蕷皂甙標(biāo)準(zhǔn)品 純度>98%,上海永葉生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 純度>98%,美國Sigma 公司;抗壞血酸 分析純,廣州萬從化工有限公司;乙醇、三氯甲烷、冰醋酸、高氯酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸、磷酸二氫鈉 均為國產(chǎn)分析純。

HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;80-2型臺式低速離心機(jī) 金壇市順華儀器有限公司;UV-722型可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司;NJL07-3型實驗專用微波爐 南京杰全微波設(shè)備有限公司;TG-328A型分析天平 上海試驗儀器廠;SHZ-Ⅲ型臺式循環(huán)水式真空泵 上海英化儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 梔子皂甙的提取 根據(jù)文獻(xiàn)[8]準(zhǔn)確稱取梔子粉末1.00 g,按一定的比例溶于一定濃度的乙醇溶液中,在一定的微波功率下處理一定時間,在一定溫度下,浸提一定時間后,過濾得到的清液,用鹽酸調(diào)pH至1～2、靜置過濾得沉淀物,再用NaOH溶液調(diào)至溶解后,加入95%乙醇攪拌過濾,最后再次用鹽酸調(diào)pH至1～2,過濾得梔子皂甙結(jié)晶。

1.2.2 單因素實驗設(shè)計 固定乙醇濃度80%(V/V),微波功率450 W,微波時間40 s,浸提時間5 min和浸提溫度20 ℃,分別設(shè)置液固比為5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1 (mL/g),考察固液比對梔子皂苷得率的影響;

固定液固比10∶1 (mL/g),乙醇濃度80%(V/V),微波時間40 s,浸提時間5 min和浸提溫度20 ℃,分別設(shè)置微波功率為150、300、450、600、750(W),考察微波功率對梔子皂苷得率的影響;

固定液固比10∶1 (mL/g),乙醇濃度80%(V/V),微波功率450 W,浸提時間5 min和浸提溫度20 ℃,分別設(shè)置微波時間為10、20、30、40、50(s),考察微波時間對梔子皂苷得率的影響;

固定液固比10∶1 (mL/g),乙醇濃度80%(V/V),微波功率450 W,微波時間40 s和浸提時間5 min,分別設(shè)置浸提溫度為20、30、40、50、60 ℃,考察浸提溫度對梔子皂苷得率的影響;

固定液固比10∶1 (mL/g),乙醇濃度80%(V/V),微波功率450 W,微波時間40 s和浸提溫度20 ℃,分別設(shè)置浸提時間為5、10、15、20、25 min,考察浸提時間對梔子皂苷得率的影響;

固定液固比10∶1 (mL/g),微波功率450 W,微波時間40 s,浸提時間5 min和浸提溫度20 ℃,分別設(shè)置乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%(V/V),考察乙醇濃度對梔子皂苷得率的影響;每個實驗平均三次,結(jié)果取平均值。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,考慮到乙醇濃度和微波功率對梔子皂甙得率影響相對較小,因此恒定乙醇濃度為80%,微波功率為450 W,采用Box-Behnken設(shè)計方法,以皂甙得率(Y)為響應(yīng)值,以液固比(X1)、微波時間(X2)、浸提時間(X3)和乙醇濃度(X4)這4個因素為自變量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗,具體因素水平見表1。

《普通高中數(shù)學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)(實驗)》強(qiáng)調(diào)：“數(shù)學(xué)教學(xué)要使學(xué)生通過不同形式的自主學(xué)習(xí)、探究活動，體驗數(shù)學(xué)發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)造的歷程.”從數(shù)學(xué)學(xué)科特點出發(fā),根據(jù)不同的教學(xué)內(nèi)容,有效合理地組織學(xué)生開展“探究教學(xué)”，是追求有效教學(xué)、構(gòu)建高效課堂的重要途徑.在目前課堂教學(xué)中，“探究教學(xué)”中探究的成分太少,有種“貼標(biāo)簽”的嫌疑.筆者認(rèn)為，數(shù)學(xué)課堂教學(xué)過程中的每一個環(huán)節(jié)都可以滲透探究的元素、探究方法、探究思想.我們應(yīng)力求讓探究成為數(shù)學(xué)課堂教學(xué)的常態(tài),應(yīng)善于把握課堂教學(xué)中的每一個探究機(jī)會和細(xì)節(jié)，使數(shù)學(xué)探究逐步成為學(xué)生學(xué)習(xí)的自覺行為乃至形成習(xí)慣,促進(jìn)學(xué)生思維充分、健康、全面發(fā)展.

表1 響應(yīng)面因素及水平表Table 1 Factors and levels table of response surface analysis

1.2.4 梔子皂甙得率的計算

1.2.4.1 溶液的配制 薯蕷皂甙標(biāo)準(zhǔn)對照液配制:精確稱取薯蕷皂甙標(biāo)準(zhǔn)品固體1.00 mg于燒杯中,溶解于無水乙醇中,然后用無水乙醇定容到10 mL的容量瓶中,搖勻,得濃度0.10 mg/mL的薯蕷皂甙標(biāo)準(zhǔn)對照液。

5%香草醛冰醋酸溶液的配制:準(zhǔn)確稱取5.00 g香蘭素粉末于燒杯中,加入濃度99.5%冰醋酸溶解,并定容到100 mL容量瓶中,混勻。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 根據(jù)文獻(xiàn)[9]的方法,量取薯蕷皂甙標(biāo)準(zhǔn)品對照液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL,分別置于10 mL具塞試管中,沸水浴一段時間直至溶劑被揮干,再將0.20 mL的5.0%香草醛冰醋酸溶液和0.80 mL的濃度99.5%高氯酸溶液加入試管中,密塞混勻,然后置于60 ℃中水浴顯色15 min,顯色完全后取出,冰水浴冷卻5 min,然后加入5.0 mL的冰醋酸溶液,均勻混合,靜置10 min。與空白試劑管對照,用分光光度計在波長544 nm處測其吸光度,橫坐標(biāo)為薯蕷皂甙濃度m(mg/mL),縱坐標(biāo)為吸光度A,繪制薯蕷皂甙標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程為:A=0.9826m+0.0012,R2=0.9996。

1.2.4.3 得率的計算 將皂甙晶體用5.00 mL 95%乙醇溶解于具塞試管中,采用香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法測其吸光度值,根據(jù)測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線線方程計算梔子提取液中皂甙含量,梔子皂甙得率按式(1)計算。

式(1)

式中:Y為梔子皂甙得率,%;C為測定提取液中梔子皂甙濃度,mg/mL;V為梔子皂甙提取液體積,mL;M為梔子粉末質(zhì)量,mg。

1.2.5 梔子皂甙抗氧化能力的測定

1.2.5.2 梔子皂甙還原能力的測定 取質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的梔子皂甙溶液2.50 mL分別于10 mL離心管內(nèi),再加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鈉緩沖液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液,50 ℃水浴20 min,加入2.5 mL 10%三氯乙酸后混勻,在3000 r/min離心10 min,取上清液5.0 mL再加5.0 mL水于試管中,再加1 mL 0.1%三氯化鐵,搖勻混合后,靜置10 min,在波長700 nm處測其吸光度,用抗壞血酸作比較;每個濃度均做3次平行試驗[10]。計算吸光度的平均值。

1.2.5.2 梔子皂甙對DPPH清除力的測定 分別取質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的梔子皂甙溶液2.0 mL,加入2.0 mL用無水乙醇配制的0.8 mmol/mL DPPH溶液,用力振搖混勻后在黑暗環(huán)境中靜置30 min,于517 nm 處測定其吸光度,用抗壞血酸作比較[11];每個濃度均做3次平行試驗,DPPH自由基清除率按式(2)計算。

式(2)

式中:Ax為加入樣品溶液后的吸光度;Ax0為樣品溶液本底的吸光度;A0為空白對照液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗操作重復(fù)三次取平均值,應(yīng)用分析統(tǒng)計軟件采用SAS RSREG程序?qū)υ囼炦M(jìn)行設(shè)計,并對結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 液固比對皂甙得率的影響 如圖1所示,皂甙得率隨液固比的提高呈現(xiàn)先升后降的趨勢,皂甙得率在液固比為20∶1 (mL/g)時達(dá)到最高,為10.03%,隨著液固比的增加會增大傳質(zhì)驅(qū)動力,從而提高皂甙得率,但達(dá)到一定液固比20∶1 (mL/g)后反而減小，主要原因是浸提劑對微波能量的吸收增加,導(dǎo)致細(xì)胞液對微波能量的吸收減少,細(xì)胞壁的破裂不完全,皂甙不能從細(xì)胞中充分溶出[12]，因此，選擇的液固比為20∶1 (mL/g)。

圖1 液固比對梔子皂甙得率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on the extraction yield of Gardenia jasminoides Ellis saponins

2.1.2 微波功率對皂甙得率的影響 從圖2可以看出,皂甙得率隨微波功率的提高呈現(xiàn)先升后降的趨勢,在微波功率為450 W時,提取效果最好,皂甙得率達(dá)到最大值，為7.37%。微波功率過高可能會破壞皂甙分子結(jié)構(gòu),使熱不穩(wěn)定的粗皂甙提取物出現(xiàn)分解或部分分解現(xiàn)象[13],導(dǎo)致皂甙得率降低,而功率過低時,不能很好地破碎細(xì)胞使皂甙溶出,皂甙得率也較低。因此，選擇的微波功率為450 W。

圖2 微波功率對梔子皂甙得率的影響Fig.2 Effect of microwave power on the extraction yield of Gardenia jasminoides Ellis saponins

2.1.3 微波時間對皂甙得率的影響 由圖3可知,隨著微波時間的延長,皂甙的皂甙得率呈現(xiàn)先升后降的趨勢,微波時間為40 s時,皂甙得率最高,為7.10%。原因可能是隨著微波時間的延長,溶出物增多,梔子皂甙得率增高,繼續(xù)延長微波時間,細(xì)胞膜進(jìn)一步破裂,樣品中的黏液質(zhì)等雜質(zhì)進(jìn)入浸出液,使得浸出液黏度增大,從而擴(kuò)散速度緩慢,皂甙得率反而變小[12]。因此，選擇的微波時間為40 s。

圖3 微波時間對梔子皂甙得率的影響Fig.3 Effect of microwave time on the extraction yield of Gardenia jasminoides Ellis saponins

2.1.4 浸提溫度對皂甙得率的影響 由圖4可知,皂甙得率隨浸提溫度的提高呈現(xiàn)先升后降的趨勢,皂甙浸提溫度為50 ℃時,皂甙得率最大，為7.86%,表明溫度越高越有利于皂甙的溶出,但是溫度太高時,梔子中皂甙有可能發(fā)生氧化分解等變化,影響試驗結(jié)果[14]。因此，選擇的浸提溫度為50 ℃。

圖4 浸提溫度對梔子皂甙得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction yield of Gardenia jasminoides Ellis saponins

2.1.5 浸提時間對皂甙得率的影響 如圖5可知,皂甙得率隨浸提時間的提高呈現(xiàn)先升后降的趨勢,浸提時間為10 min時,皂甙得率達(dá)到最大值,為11.02%。這是因為隨著浸提時間的延長,梔子粉末與溶劑充分接觸,皂甙分子溶出增多，皂甙得率增大,浸提時間較長時，過長時間浸泡在20 ℃的溫度下,細(xì)胞膜進(jìn)一步破裂,樣品中的黏液質(zhì)等雜質(zhì)進(jìn)入浸出液,使得浸出液黏度增大,從而使其擴(kuò)散速度緩慢,過濾困難，導(dǎo)致皂甙損失[12]。因此，選擇的浸提時間為10 min。

圖5 浸提時間對梔子皂甙得率的影響Fig.5 Effects of extraction time on the extraction yield of Gardenia jasminoides Ellis saponins

2.1.6 乙醇濃度對皂甙得率的影響 由圖6可知,皂甙得率隨乙醇濃度的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢,乙醇濃度為80%時,皂甙得率達(dá)到最大值,為7.27%,在此濃度下提取效果最好。因為乙醇極性較高對梔子皂甙的溶解度大,乙醇濃度增大皂甙溶出率較多,但過高的濃度會對皂甙造成破壞作用而降低得率,在微波作用下這種差異更為明顯[15]。因此，選擇的乙醇濃度為80%。

圖6 乙醇濃度對梔子皂甙得率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of Gardenia jasminoides Ellis saponins

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝結(jié)果分析

2.2.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗 根據(jù)Box-Behnken方法設(shè)計響應(yīng)面結(jié)果見表2,將表2的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和回歸分析,并建立二次回歸模型方程:

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Program and experimental results of response surface method

式(3)

對上述模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3。此模型的p<0.0001,表明響應(yīng)面模型達(dá)到極顯著,失擬項p=0.1591>0.05,不顯著,說明該模型與實際實驗擬合度良好,R2=0.9206,說明該模型能解釋92.06%實驗數(shù)據(jù)的變異性,模型的擬合良好,試驗誤差小,模型的可行度較高。因此,該模型可用于梔子皂甙微波提取的分析和預(yù)測。

表3 模型回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of regression equation

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 響應(yīng)曲面越陡峭,說明該因素對響應(yīng)值改變越敏感,曲面越平滑,該因素改變對響應(yīng)值影響越小[16],各因素的回歸響應(yīng)面圖見圖7,由此可見,隨著微波時間(X2)和浸提時間(X3)兩因素取值改變其響應(yīng)曲面線變化也越陡峭,表明這兩因素對梔子皂甙得率交互影響顯著,其它因素之間隨取值變化其響應(yīng)曲面線變化較為平緩,表明其它兩兩因素的交互作用對梔子皂甙得率影響不顯著,這與表3中交互項p值的分析結(jié)果一致,由圖7還可以看出,6個響應(yīng)曲面均為開口向下的凸形曲面,液固比(X1)、微波時間(X2)、浸提時間(X3)和乙醇濃度(X4)4個因素與梔子皂甙得率(Y)呈拋物線關(guān)系,且在考察范圍內(nèi)存在響應(yīng)值的極高值。

圖7 液固比、微波時間、浸提時間和乙醇濃度等交互作用對梔子皂甙得率的影響Fig.7 Response surface plot and contour plot of the effects of liquid-solid ralio, microwave time,extract time and ethanol concentration on the the yield of Gardenin jasminoides Ellis

2.2.3 最佳工藝的提取與驗證 由SAS軟件綜合分析得出,梔子皂甙提取最佳條件為:液固比21.44∶1 (mL/g)、微波時間40.02 s、浸提時間9.6 min、乙醇濃度80.05%,在此條件下梔子皂甙的得率預(yù)測值為13.64%?？紤]到可行性,將以上結(jié)果校正為:液固比21∶1 (mL/g)、微波時間為40 s、乙醇濃度為80%、浸提時間為9.6 min。此條件下,重復(fù)實驗5次,梔子皂甙平均得率為13.92%±0.04%,實際得率與理論預(yù)測皂甙得率的相對誤差僅為2.05%,由此可見此模型和方法是可靠有效的。

2.3 梔子皂甙抗氧化能力測定結(jié)果

2.3.1 梔子皂甙還原能力的測定結(jié)果 由圖8可知,梔子皂甙的還原能力隨濃度的上升而增加,但遠(yuǎn)小于抗壞血酸的還原能力,此結(jié)論與武海霞[17]發(fā)現(xiàn)梔子皂苷具有良好的還原能力相一致,但是遠(yuǎn)小于抗壞血酸的還原能力的原因可能是微波輔助提取可能會對梔子皂甙的分子結(jié)構(gòu)及其效用有一定的影響,從而導(dǎo)致其還原能力發(fā)生一定程度的改變[18]。

圖8 梔子皂甙和抗壞血酸還原能力Fig.8 Comparison of reducing power between different concentration saponins in Gardenia jasminoides Ellis and ascorbic acid

2.3.2 梔子皂甙對DPPH自由基的清除能力測定結(jié)果 由圖9可知,梔子皂甙和抗壞血酸對DPPH自由基的清除率隨其濃度的提高而增大,與濃度呈現(xiàn)正相關(guān)性[19],但在梔子皂甙濃度從0.05增加至0.10 mg/mL時,DPPH自由基清除率增加到38.2%,隨后增長速度趨于平緩;圖9數(shù)據(jù)顯示,相同濃度下梔子皂甙比抗壞血酸DPPH自由基清除能力要低,但清除率最高達(dá)38.2%,梔子皂甙對DPPH自由基具有一定的清除能力。

圖9 梔子皂甙和抗壞血酸對DPPH自由基的清除效果Fig.9 Scavenging ability of different concentration saponins in Gardenia and ascorbic acid on DPPH

3 結(jié)論

通過單因素試驗和響應(yīng)面法試驗,得到梔子皂甙提取的最佳條件為:液固比21∶1 (mL/g)、微波時間40 s、浸提時間9.6 min、乙醇濃度80%、微波功率450 W和浸提溫度50 ℃。該條件下,得到實際梔子皂甙得率為13.92%±0.04%,與理論值13.64%相近,實際得率與理論預(yù)測皂甙得率的相對誤差僅為2.05%;微波輔助法提取梔子皂甙簡便、提取得率高,回歸模型合理可靠,可用于實際預(yù)測;抗氧化活性研究表明，梔子皂甙對羥基自由基和DPPH自由基均有良好的清除能力,但其總體抗氧化性低于抗壞血酸,試驗結(jié)果表明,梔子皂甙具有一定的抗氧化能力,可進(jìn)一步開發(fā)成天然抗氧化劑。