蘇 靜，龔 榮

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801）

近年來，隨著人們對(duì)谷胱甘肽（glutathione，GSH）認(rèn)識(shí)的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)這種廣泛分布于自然界的小分子肽與人類生產(chǎn)和生活有著密切關(guān)系。GSH是葡萄果肉中天然存在的小分子巰基化合物，是一種內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)。葡萄酒釀造期間，GSH能夠有效防止葡萄酒中酚類物質(zhì)的氧化，保護(hù)葡萄酒的芳香物質(zhì)和色澤；在葡萄酒貯藏階段，GSH能夠防止葡萄酒變質(zhì)，并延長酒的貨架期。2015年第38屆世界葡萄與葡萄酒大會(huì)暨第13屆國際葡萄與葡萄酒組織大會(huì)通過了兩項(xiàng)決議，分別是向葡萄汁（OIV-OENO 445—2015）和葡萄酒（OIVOENO 446—2015）中添加還原型GSH的操作規(guī)范，建議在葡萄汁和葡萄酒中添加還原型GSH來保護(hù)葡萄酒的色澤和風(fēng)味，規(guī)定最大使用劑量均為20 mg/L。然而，這種做法并沒有獲得歐盟的認(rèn)可。另外，許多葡萄酒生產(chǎn)廠商也選擇采用高產(chǎn)GSH的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或者非活性干酵母（又稱為惰性酵母或滅活酵母）來增加酒中還原型GSH的含量，以改善葡萄酒品質(zhì)。

近年來，國外關(guān)于葡萄、葡萄汁和葡萄酒釀造過程中還原型GSH作用的研究較多，而國內(nèi)研究較少。這些研究大多數(shù)集中在葡萄中GSH或者果香硫醇前體物對(duì)葡萄酒揮發(fā)性硫醇的影響，GSH對(duì)葡萄酒中化學(xué)成分尤其是香氣物質(zhì)和色澤的影響；葡萄酒釀造過程中GSH含量的變化；高產(chǎn)GSH酵母菌株的篩選及其對(duì)乙醇發(fā)酵的影響等方面。全面認(rèn)識(shí)和理解GSH在葡萄酒釀造過程中的作用，對(duì)更好地監(jiān)控并提高GSH含量，防止葡萄酒氧化及保護(hù)葡萄酒的香氣具有重要意義，這也為高品質(zhì)葡萄酒的釀造提供一定的理論基礎(chǔ)。本文分析了國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，以對(duì)葡萄酒釀造過程中GSH的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 谷胱甘肽的結(jié)構(gòu)和特性

GSH是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸三種氨基酸組成的三肽，是生物體中（包括植物、動(dòng)物和真菌）最普遍存在的細(xì)胞內(nèi)巰基物質(zhì)，具有很強(qiáng)的抗氧化性。GSH中的半胱氨酸殘基（巰基部分）賦予其獨(dú)特的氧化還原反應(yīng)和親核性能，使其成為生物體抗氧化系統(tǒng)中重要的組成成分。GSH具有兩種存在形式，分別是還原型GSH和GSH二硫化物（glutathione disulfide，GSSG）[1]，見圖1、2。

圖1 還原型GSH（A）和GSSG（B）分子結(jié)構(gòu)[2]Fig. 1 Molecular structures of reduced GSH (A) and glutathione disulfide (B)[2]

當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，還原型GSH和GSSG之間可以進(jìn)行相互轉(zhuǎn)換。還原型GSH能夠在GSH過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）催化下轉(zhuǎn)化為GSSG和水，而GSSG也能夠在GSH還原酶（glutathione reductase，GR）作用下，以NADPH作為輔因子轉(zhuǎn)化為還原型GSH。此外，還原型GSH還參與了氧化蛋白的還原。谷氧還蛋白（glutaredoxin，Grx）是一種修復(fù)蛋白質(zhì)活性的小分子酶蛋白，在GSSG與還原型GSH之間進(jìn)行轉(zhuǎn)化的過程中，Grx中的二硫鍵被還原為巰基[3-4]。

圖2 還原型GSH在細(xì)胞中的主要功能[3--4]Fig. 2 Major functions of reduced GSH in cells[3-4]

2 葡萄果實(shí)中的谷胱甘肽

1989年，Cheynier等[5]首次在葡萄中發(fā)現(xiàn)了GSH。葡萄漿果中90%以上的GSH都是還原型GSH，其含量為17～114 mg/kg[5-10]。在外界條件良好的情況下，植物葉片中還原型GSH和GSSG的比例約為20∶1。隨著葡萄的成熟，葡萄漿果中還原型GSH的含量逐漸增加。葡萄品種、葡萄采收期和葡萄栽培技術(shù)等都會(huì)影響還原型GSH含量。研究發(fā)現(xiàn)，降低葉片中還原型GSH含量可以增加葡萄漿果中還原型GSH的含量，因此，可以在葡萄漿果剛開始進(jìn)入成熟期時(shí)就進(jìn)行栽培管理，使葉片中的還原型GSH轉(zhuǎn)移到葡萄藤的韌皮部位，繼而轉(zhuǎn)移到葡萄漿果中；此外，摘葉處理也會(huì)增加葡萄中還原型GSH的含量，然而這一現(xiàn)象并不具有普遍性[7,10-11]。還原型GSH在葡萄中積累的機(jī)制以及不同的栽培方式對(duì)葡萄中還原型GSH含量的影響仍是今后研究的重點(diǎn)。

還原型GSH還與某些品種葡萄香氣的形成有關(guān)?！L相思’是深受人們喜愛的白葡萄品種，雖然其果香不濃郁，但其所釀造的葡萄酒卻具有獨(dú)特且濃郁的風(fēng)味。這與果實(shí)中含有豐富的硫醇類物質(zhì)有關(guān)，這類物質(zhì)賦予‘長相思’葡萄有別于其他葡萄品種獨(dú)特的水果香氣，如葡萄柚、柑橘、百香果等熱帶水果的香氣[8]。葡萄果實(shí)中的還原型GSH可與硫醇結(jié)合而形成結(jié)合態(tài)硫醇前體物[8]?！L相思’葡萄中重要的硫醇前體物為GSH類和半胱氨酸類前體化合物，包括S-3-(正己醛)-GSH、S-3-(正己醇)-GSH（S-3-(hexan-1-ol)-glutathione，GSH-3MH）、S-3-(正己醇)-L-半胱氨酸（S-3-(hexan-l-ol)-L-cysteine，Cys-3MH）、4,4-甲基異丁基酮-L-半胱氨酸（4,4-(methylpentan-2-one)-L-cysteine，Cys-4MMP）和4-S-谷胱甘酰-4-甲基異丁基酮（4-S-glutathionyl-4-methylpentan-2-one，GSH-4MMP）[12]。近年來，許多葡萄品種如‘雷司令’、‘賽美蓉’、‘梅樂’、‘赤霞珠’、‘歌海娜’中也檢測(cè)到了這些果香硫醇前體物質(zhì)[13-15]。

葡萄果實(shí)中的果香硫醇前體物質(zhì)需要釀酒酵母的幫助才能夠釋放出揮發(fā)性香氣物質(zhì)。例如，釀酒酵母胱硫醚β-裂解酶可將胱硫醚類香氣前體物的C－S鍵斷裂，從而將果香硫醇類香氣物質(zhì)釋放到葡萄酒中。有些研究者認(rèn)為，GSH類前體物是通過脫除谷氨酸和甘氨酸而形成半胱氨酸偶聯(lián)產(chǎn)物[16]。通常認(rèn)為硫醇前體物的濃度應(yīng)與揮發(fā)性硫醇的濃度有關(guān)，事實(shí)上，在發(fā)酵過程中只有一小部分的芳香硫醇被釋放出來[17-19]。這與釀酒酵母中胱硫醚β-裂解酶的活性較低有關(guān)，據(jù)報(bào)道，只有3.2%的胱硫醚類香氣前體物被裂解[20]。馬捷等[20]構(gòu)建了具有較高胱硫醚β-裂解酶活性的酵母工程菌株，其胱硫醚β-裂解酶活力與出發(fā)菌株相比提高了32.25%～59.44%，在‘長相思’干白酒中硫醇類物質(zhì)的產(chǎn)量提高了1.22 倍。

3 葡萄汁中的谷胱甘肽

據(jù)報(bào)道，葡萄汁中還原型G S H質(zhì)量濃度在1.1～102 mg/L之間[5,9,21-25]，其含量與葡萄品種、葡萄汁中酪氨酸酶活性、氧氣、浸漬和壓榨等因素有關(guān)[7,9]。葡萄榨汁后，葡萄汁中還原型GSH含量迅速下降，它與對(duì)羥基肉桂酸乙酯發(fā)生氧化反應(yīng)生成無色的反應(yīng)產(chǎn)物——2-S-谷胱甘酰咖啡酰酒石酸，也被稱為葡萄反應(yīng)產(chǎn)物（grape reaction product，GRP）。白葡萄汁中GSSG質(zhì)量濃度在0.46～2.93 mg/L之間，氧化造成葡萄汁中GSSG質(zhì)量濃度上升，GSSG可以作為判斷葡萄汁氧化程度的指示劑[7]。

‘長相思’葡萄壓榨后，葡萄汁中Cys-3MH含量大幅增加，而GSH-3MH含量較少。這是因?yàn)樵贕SH S-轉(zhuǎn)移酶作用下，GSH-3MH可被轉(zhuǎn)化為Cys-3MH[26-27]。凍融處理也會(huì)影響葡萄中還原型GSH的代謝，從而造成葡萄汁中GSH-3MH含量的變化[12]。Thibon等[28]發(fā)現(xiàn)‘長相思’和‘賽美蓉’葡萄感染貴腐霉菌（Botrytis cinerea）后，其葡萄汁中揮發(fā)性硫醇前體物的濃度會(huì)大大提高。這是因?yàn)橘F腐霉菌分泌的代謝物促進(jìn)了(E)-2-乙烯醛的形成，它與還原型GSH結(jié)合后可轉(zhuǎn)化為Cys-3MH[29]。

4 發(fā)酵和陳釀過程中的谷胱甘肽

4.1 谷胱甘肽與乙醇發(fā)酵

葡萄酒中的GSH一部分來源于葡萄本身，另一部分來自乙醇發(fā)酵階段酵母菌的代謝。與葡萄和葡萄汁相比，葡萄酒中還原型GSH的質(zhì)量濃度較低（0～70 mg/L），并且具有高度可變性[7,22,30-34]。葡萄品種、釀造工藝、酵母菌株、酒泥和陳釀環(huán)境等均會(huì)影響葡萄酒中GSH的含量。

在乙醇發(fā)酵過程中，葡萄汁中的還原型GSH成為釀酒酵母良好的“營養(yǎng)品”，它被酵母吸收并為酵母提供營養(yǎng)，促進(jìn)了乙醇發(fā)酵進(jìn)程。然而葡萄酒中還原型GSH含量的變化往往是比較復(fù)雜的，其含量可能會(huì)升高[21-22,24-25]，這是因?yàn)獒劸平湍复x并分泌出一部分還原型GSH或酵母吸收了還原型GSH前體物質(zhì)合成了還原型GSH，從而導(dǎo)致發(fā)酵醪中還原型GSH含量增加。這一過程是由釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)Gex1基因進(jìn)行調(diào)控[35-37]。釀酒酵母吸收和釋放還原型GSH的程度取決于酵母菌株自身的遺傳背景、代謝能力以及環(huán)境因素，如外界溫度、pH值、滲透壓、營養(yǎng)成分的含量和比例（碳源、氮源、半胱氨酸）等[21,38-39]。生長在富含高濃度還原型GSH環(huán)境中的酵母，其胞內(nèi)還原型GSH含量也較高[21]。Park等[24-25]認(rèn)為葡萄汁中總氮或可吸收氮的含量與葡萄酒中還原型GSH水平之間具有明顯相關(guān)性，然而Kritzinger[30]對(duì)這一結(jié)果并不認(rèn)可。乙醇發(fā)酵后還原型GSH含量還可能會(huì)下降[7,10,40]。Patel等[10]研究證實(shí)了這一過程，他們采用添加了高質(zhì)量濃度（67 mg/L）還原型GSH的葡萄汁進(jìn)行乙醇發(fā)酵，經(jīng)檢測(cè)，發(fā)酵后每升葡萄酒中僅有幾毫克還原型GSH。這是因?yàn)獒劸平湍缸陨磙D(zhuǎn)運(yùn)蛋白吸收了發(fā)酵醪中的還原型GSH或是由于還原型GSH轉(zhuǎn)化成GRP所導(dǎo)致的[35,37]。

在原料和釀造工藝不變的條件下，酒中還原型GSH含量主要是由釀酒酵母代謝所決定。通過選育高產(chǎn)還原型GSH的釀酒酵母可以提高葡萄酒抗氧化的能力。目前，市場(chǎng)上存在一類富含還原型GSH的商業(yè)活性干酵母（GSH-inactive dry yeast，GSH-IDY），其具有提高葡萄酒中還原型GSH含量和增強(qiáng)葡萄酒感官穩(wěn)定性的功能[30,41-43]。這類產(chǎn)品的生產(chǎn)廠商有拉曼（Lallemand）、拉氟德（Laffort）和英納帝斯（Enartis）等。乙醇發(fā)酵過程中，GSH-IDY是通過釋放自身還原型GSH和吸收還原型GSH前體物來增加葡萄酒中還原型GSH的含量。不同GSH-IDY釋放還原型GSH水平不同，在1.45～2.53 mg/L之間，總GSH釋放量在1.63～3.44 mg/L之間[21,30]。然而，并非所有GSH-IDY都能在乙醇發(fā)酵過程中釋放還原型GSH，這可能與菌株、釀酒工業(yè)環(huán)境等因素有關(guān)[21]。此外，GSH-IDY通過釋放甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸等多種氨基酸，不僅增加了葡萄酒中氨基酸的含量，也具有促進(jìn)釀酒酵母產(chǎn)生還原型GSH的作用[39,41]。Kritzinger[30]認(rèn)為具有較高氮吸收水平的GSH-IDY釀造的葡萄酒中還原型GSH含量也較高，并建議在乙醇發(fā)酵初期人工補(bǔ)加還原型GSH。此外，生產(chǎn)活性干酵母所需的熱加工過程也可能造成還原型GSH釋放量的改變。在GSH-IDY制備的干燥階段，還原型GSH與還原糖之間發(fā)生美拉德反應(yīng)會(huì)在一定程度上造成還原型GSH損失。許多研究者認(rèn)為采用富含還原型GSH的酵母菌株進(jìn)行葡萄酒乙醇發(fā)酵，能夠顯著提高成品葡萄酒中還原型GSH的含量[30,44-45]。然而，F(xiàn)racassetti等[22]認(rèn)為酵母菌株對(duì)葡萄酒中還原型GSH含量的影響甚微。乙醇、SO2等因素也會(huì)造成GSH-IDY釋放還原型GSH量的差異[8]，然而目前相關(guān)的報(bào)道較少。

篩選高產(chǎn)還原型GSH的釀酒酵母仍是目前研究熱點(diǎn)之一[46]。釀酒酵母中還原型GSH的含量與菌株、生長環(huán)境等因素有關(guān)。硫酸鹽還原途徑是釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)含硫化合物合成的重要途徑。釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的GSH是γ-谷?；?半胱氨酸、谷氨酸和半胱氨酸在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（由GSH1基因編碼）和GSH合成酶（由GSH2基因編碼）催化下合成[47]。對(duì)鉬酸鹽具有高抵抗能力的釀酒酵母往往會(huì)分泌較多的還原型GSH。因此，研究者常利用鉬酸鹽進(jìn)行高產(chǎn)還原型GSH釀酒酵母的篩選。其原因可能是鉬酸鹽激活了釀酒酵母中與金屬脅迫響應(yīng)相關(guān)的代謝途徑，包括硫同化途徑以及還原型GSH的合成和代謝途徑[47]。Mezzetti等[47]采用基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法對(duì)這一相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究，認(rèn)為氨基酸通透酶、與氨基酸生物合成前體有關(guān)的酶以及與氧化脅迫有關(guān)的酶等也參與了這一過程。

將酵母滅活后獲得的具有葡萄酒芳香保護(hù)能力的非活性干酵母產(chǎn)品也深受釀酒師喜歡。非活性干酵母富含還原型GSH和還原型GSH前體物質(zhì)（如半胱氨酸），還含有酵母多糖（如甘露糖蛋白）、礦物質(zhì)、微量元素等豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。在酒精發(fā)酵過程中，這類產(chǎn)品能為酵母提供營養(yǎng)，促進(jìn)釀酒酵母中GSH前體物質(zhì)的合成，從而進(jìn)一步合成還原型GSH，保證酒精發(fā)酵的順利進(jìn)行。研究顯示，在白葡萄酒發(fā)酵過程中，添加富含還原型GSH的非活性干酵母，能減少H2S的產(chǎn)生，穩(wěn)定白葡萄酒的香氣，改善葡萄酒的口感。

4.2 谷胱甘肽與蘋果酸-乳酸發(fā)酵

蘋果酸-乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）是將葡萄酒中二元蘋果酸轉(zhuǎn)化為一元乳酸和二氧化碳的過程，從而降低葡萄酒酸度，提高葡萄酒的穩(wěn)定性，并豐富葡萄酒風(fēng)味、增強(qiáng)酒的結(jié)構(gòu)感和馥郁度。酒酒球菌（Oenococcus oeni）是MLF的主要啟動(dòng)者，然而葡萄酒中高濃度的乙醇、較低的pH值以及高SO2含量等因素，往往使這一發(fā)酵過程變得緩慢，甚至難以啟動(dòng)。研究表明，MLF過程中，葡萄酒中總GSH含量顯著降低，降低量約為初始值的21%～36%；而還原型GSH和GSSG的變化并沒有明顯規(guī)律[48]。

還原型GSH能夠提高酒酒球菌對(duì)酸脅迫或/和乙醇脅迫環(huán)境的耐受性，增強(qiáng)其生長能力，提高M(jìn)LF速率[3-4,49-51]。雖然酒酒球菌不能合成還原型GSH，但它具有吸收外源還原型GSH的能力，這種能力因菌株的不同而有差異[4]。酒酒球菌中含有一些與還原型GSH代謝相關(guān)的酶和蛋白，包括Grx、GSH-Px、GR和假想還原型GSH轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[52-55]。還原型GSH提高酒酒球菌環(huán)境脅迫耐受性的機(jī)理可能是調(diào)節(jié)其細(xì)胞膜脂肪酸成分以適應(yīng)環(huán)境，并且提高了菌株脅迫適應(yīng)性相關(guān)基因hsp18和clp在發(fā)酵初期的相對(duì)表達(dá)水平[4]。谷氧還蛋白基因grx和cydC是參與還原型GSH保護(hù)酒酒球菌抵御酸或乙醇脅迫過程中的關(guān)鍵基因[49]。還原型GSH（5 mmol/L）的添加使得供試菌株中基因rdx3（OEOE_RS04215）、cydC和rdx2高表達(dá)[49]。蘇靜[51]在添加了還原型GSH的培養(yǎng)基中對(duì)酒酒球菌SD-2a進(jìn)行預(yù)適應(yīng)性培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與酒酒球菌脅迫適應(yīng)性相關(guān)的基因hsp18、citE、clpP、ctsR和rmlB在MLF前期的相對(duì)表達(dá)水平提高，并建議采用添加還原型GSH的培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，以此來提高其在葡萄酒中的生存能力并促進(jìn)MLF進(jìn)程。另外，GR在酒酒球菌處理由乙醇脅迫導(dǎo)致的氧化損傷和維持細(xì)胞氧化還原平衡方面發(fā)揮重要作用[50]。

雖然研究發(fā)現(xiàn)還原型GSH能夠增強(qiáng)酒酒球菌的酸或/和乙醇脅迫耐受性，但是其機(jī)理并不十分清楚。酸或/和乙醇應(yīng)激反應(yīng)過程是一個(gè)非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系，添加的外源氨基酸可能通過誘導(dǎo)菌體內(nèi)部其他蛋白質(zhì)發(fā)生變化來應(yīng)對(duì)這些脅迫。關(guān)于還原型GSH、MLF以及酒酒球菌之間的關(guān)系，以及如何更好地利用還原型GSH來促進(jìn)MLF進(jìn)程，提高葡萄酒質(zhì)量，未來還需要進(jìn)一步的探索。

4.3 谷胱甘肽與陳釀

無論何種類型的葡萄酒，陳釀后酒中還原型GSH含量均逐漸降低[11,21,30,45]，且其下降幅度大于總GSH的下降幅度[30]。葡萄酒進(jìn)行壓榨操作，不僅促進(jìn)了多酚的氧化，還會(huì)造成還原型GSH含量快速下降，而陳釀后酒中還原型GSH含量的下降幅度更大[10-11]。Lavigne等[45]也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)壓榨后的葡萄酒若在新橡木桶中陳釀，會(huì)因木材的氧化反應(yīng)導(dǎo)致消耗還原型GSH的速率加快。

白葡萄酒對(duì)氧氣非常敏感，陳釀時(shí)要特別注意酒中氧氣的濃度。通常葡萄酒在低氧環(huán)境中受到氧化的程度較低，陳釀后的酒中還原型GSH含量較高。Arapitsas等[56]發(fā)現(xiàn)半胱氨酸和還原型GSH在葡萄酒陳釀期間會(huì)發(fā)生磺化反應(yīng)形成半胱氨酸硫酸鹽和GSH硫酸鹽。他們認(rèn)為這與葡萄酒裝瓶時(shí)接觸了大量的氧氣有關(guān)。此外，Lavigne等[45]認(rèn)為酒泥可能具有保護(hù)還原型GSH的作用。

5 谷胱甘肽在葡萄酒釀造過程中的作用

5.1 谷胱甘肽防止葡萄汁和葡萄酒的氧化并保護(hù)葡萄酒的色澤

葡萄酒釀造過程的實(shí)質(zhì)是酵母菌、乳酸菌等微生物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的過程，這個(gè)過程易受到環(huán)境溫度、pH值、氧以及不良微生物等的影響。葡萄漿果破碎后迅速接觸到大量氧氣，在多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）催化下發(fā)生酶促氧化褐變，葡萄汁中的酚類物質(zhì)被氧化成鄰苯醌，鄰苯醌通過與葡萄汁中的活躍成分進(jìn)行聚合和縮合形成褐色物質(zhì)，致使葡萄酒氧化褐變[57]。Li Hua等[57]認(rèn)為在葡萄酒眾多多酚類物質(zhì)中，咖啡酸和兒茶素是最易被氧化的鄰苯二酚類物質(zhì)。在葡萄酒陳釀階段，這些物質(zhì)還可經(jīng)非酶氧化（化學(xué)氧化）形成鄰苯醌。傳統(tǒng)葡萄酒工業(yè)生產(chǎn)中常采用添加SO2的方式防止葡萄汁和葡萄酒的氧化褐變，SO2通過不可逆地與PPO（氧化型和過渡型）發(fā)生絡(luò)合作用，從而抑制PPO活性。這種方法不僅廉價(jià)而且有效，因此一直沿用至今。然而，過量使用SO2會(huì)使葡萄酒色澤異常，還會(huì)造成人體過敏，危害人體健康。

還原型GSH能夠防止葡萄汁和葡萄酒的氧化褐變[11,58-67]。雖然還原型GSH不能抑制PPO活性，但其可以通過與醌式咖啡酰酒石酸（已被氧化的酚類物質(zhì)）反應(yīng)形成GRP，從而抑制鄰苯醌的形成和褐色聚合物的產(chǎn)生[8]。此外，當(dāng)還原型GSH濃度達(dá)到一定值時(shí)還可誘捕鄰苯醌，限制鄰苯醌引發(fā)的其他反應(yīng)[68-71]。研究人員采用超高分辨率質(zhì)譜代謝組學(xué)和感官分析相結(jié)合的方法證實(shí)了還原型GSH在白葡萄酒陳釀期間發(fā)揮了保護(hù)性作用，通過保護(hù)葡萄酒中的含氮、含硫物質(zhì)、氨基酸、芳香物質(zhì)、多肽等抗氧化代謝物來發(fā)揮其保護(hù)作用[72]。然而，SO2和銅離子等物質(zhì)也會(huì)在一定程度上限制其抗氧化作用的發(fā)揮。SO2與兒茶酚酶相互作用，生成游離咖啡酰酒石酸和對(duì)香豆酰酒石酸，而GRP容易被漆酶和醌式咖啡酰酒石酸氧化褐變[73]。銅離子可與醌式咖啡酰酒石酸相互競(jìng)爭(zhēng)爭(zhēng)奪還原型GSH，因而降低了葡萄酒中還原型GSH的有效濃度，限制了GRP的生成。此外，醌式咖啡酰酒石酸與黃烷醇的偶合氧化也增加了葡萄汁褐變的程度[5,69]。

花色素苷是構(gòu)成紅葡萄酒顏色的一類重要的多酚類物質(zhì)。紅葡萄酒顏色從紅色到黃色的轉(zhuǎn)變是葡萄酒老化的標(biāo)志，也是葡萄酒氧化變質(zhì)的表現(xiàn)。葡萄酒的氧化分為兩種：第1種是上述提到的形成醌類物質(zhì)，O2被還原產(chǎn)生了H2O2；第2種是酒中存在鐵和銅離子等微量金屬離子時(shí)，發(fā)生了芬頓（Fenton）反應(yīng)，產(chǎn)生羥自由基。二甲花翠素-3-葡萄糖苷是葡萄酒中重要的花色素苷，芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基是造成其降解的主要原因。研究證實(shí)，在pH值（pH 3.2）較低的模擬葡萄酒和紅葡萄酒中，SO2能夠清除酒中存在的H2O2，并與因芬頓反應(yīng)而產(chǎn)生的羰基化合物結(jié)合，是保護(hù)酒中二甲花翠素-3-葡萄糖苷最有效的抗氧化劑[74]。然而，單獨(dú)使用還原型GSH或者與SO2結(jié)合使用時(shí)，還原型GSH均不能起到清除H2O2的作用，因而不能抑制芬頓反應(yīng)，也不能防止二甲花翠素-3-葡萄糖苷的降解。這是由于在H2O2存在的氧化環(huán)境中，還原型GSH轉(zhuǎn)變?yōu)镚SSG，GSSG與磺酸根離子（SO3H-）反應(yīng)產(chǎn)生磺化GSH，從而造成還原型GSH的大量減少[75]。因此，葡萄酒中還原型GSH發(fā)揮抗氧化作用的機(jī)理主要是通過限制醌類物質(zhì)的合成來防止褐變，并不能通過清除酒中存在的H2O2來抑制芬頓反應(yīng)。

還原型GSH防止葡萄酒氧化褐變以及穩(wěn)定陳年葡萄酒色澤的效果依賴于其使用劑量[59-60,66,76]。研究人員在干白葡萄酒進(jìn)行瓶?jī)?chǔ)前，向酒中加入10 mg/L的還原型GSH，結(jié)果表明還原型GSH能夠有效抑制陳釀過程中葡萄酒的酶促褐變，從而防止葡萄酒色澤變黃，并減少酒中異味的生成[58]。Dubourdieu等[60]也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，他們認(rèn)為如果陳釀前白葡萄酒中還原型GSH質(zhì)量濃度超過6～10 mg/L，成品酒的顏色就可以得到更好的保護(hù)。梁曉芳等[77]向龍眼干白葡萄酒中添加20 mg/L還原型GSH，有效地減緩了酒中酚類物質(zhì)的減少和氧化褐變，延長了葡萄酒的存放時(shí)間。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)，還原型GSH有可能會(huì)破壞葡萄酒的色澤，這可能與使用的測(cè)定體系有關(guān)。Sonni等[78-79]將模擬葡萄酒貯存在溫度為45 ℃、氧氣充足且無SO2的環(huán)境中，此時(shí)，還原型GSH能夠抑制酒中o-醌衍生物酚類化合物和黃色呫噸鎓陽離子色素的形成；單獨(dú)添加還原型GSH時(shí)，葡萄酒中形成一些與對(duì)照酒（不添加還原型GSH）中聚合色素結(jié)構(gòu)不同的新的聚合色素，而這種新的聚合色素有可能會(huì)對(duì)葡萄酒的色澤產(chǎn)生影響；該研究還發(fā)現(xiàn)復(fù)合使用還原型GSH（860 mg/L）和VC（500 mg/L）能夠更好地保護(hù)葡萄酒的色澤，當(dāng)酒中存在VC時(shí)，高質(zhì)量濃度的還原型GSH（860 mg/L）能夠延緩VC的降解，抑制VC降解產(chǎn)物與黃烷醇、(+)-兒茶酸反應(yīng)，且未形成上述新的聚合色素。然而，當(dāng)VC耗盡，還原型GSH又會(huì)造成酒中聚合色素的生成。

5.2 谷胱甘肽保護(hù)葡萄酒的風(fēng)味

香氣是衡量葡萄酒品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。葡萄酒的香氣來源于葡萄本身以及釀造和成熟過程中豐富的芳香物質(zhì)，包括酯類、醇類、醛類、萜烯類、硫醇類、酮類等[8]。其中，高級(jí)醇、乙基酯類和萜烯醇類物質(zhì)能夠賦予葡萄酒果香味。2-苯乙醇是一種具有玫瑰香味的芳香醇，乙酸苯甲酯具有蘋果香氣，乙酸異戊酯具有香蕉的氣味，芳樟醇、萜品醇、橙花醇、香葉醇、脫氫芳香醇賦予葡萄果香、似玫瑰的香味[8]。葡萄酒中酯類、萜烯類、醇類物質(zhì)含量的下降意味著葡萄酒風(fēng)味的損失。在葡萄酒釀造過程中，葡萄酒風(fēng)味的變化可能是由于酒中芳香類物質(zhì)發(fā)生了氧化或其他化學(xué)反應(yīng)，如酯類物質(zhì)發(fā)生酯化和水解反應(yīng)，萜烯醇轉(zhuǎn)化為萜類氧化物，芳樟醇轉(zhuǎn)化為具有更高感官閾值的萜品醇等[80-81]。葡萄酒中的芳香物質(zhì)還會(huì)由于外界環(huán)境的變化如空氣氧化、溫度、化學(xué)反應(yīng)等而導(dǎo)致香氣成分流失，甚至產(chǎn)生異味。

許多研究證實(shí)，還原型GSH可以使葡萄酒更好地保留某些重要的酯類、萜烯類和硫醇類物質(zhì)[8]，防止其損失。研究發(fā)現(xiàn)，在白葡萄酒進(jìn)行陳釀前添加還原型GSH，可以更好地保留乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、芳樟醇和里那醇等重要的香氣物質(zhì)[61,63-65]。還原型GSH保護(hù)葡萄酒芳香物質(zhì)的機(jī)制可能是由于其結(jié)構(gòu)中存在游離的巰基組分，因而使其具有很好的自由基和過氧化物清除能力。還原型GSH對(duì)葡萄酒香氣物質(zhì)的保護(hù)效果與其質(zhì)量濃度有關(guān)[61]。Dubourdieu等[60]認(rèn)為白葡萄酒中還原型GSH的添加量大于6～1 0 mg/L，可以起到保護(hù)陳釀葡萄酒香氣的作用。Papadopoulou等[61]研究表明，在葡萄酒陳釀前，向酒中添加20 mg/L還原型GSH能夠防止該葡萄酒中芳樟醇和萜品醇含量的下降。Roussis等[64]比較了單獨(dú)使用SO2（50 mg/L）以及SO2（35 mg/L）與還原型GSH（20 mg/L）復(fù)合使用時(shí)對(duì)瓶?jī)?chǔ)后葡萄酒香氣物質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)后者能夠更有效地保護(hù)葡萄酒中的酯類物質(zhì)和芳樟醇，并且有效地保護(hù)酒中的酚類物質(zhì)尤其是咖啡酸。此外，Webber等[82]發(fā)現(xiàn)還原型GSH的添加對(duì)葡萄酒中游離SO2、總酚、兒茶素、表兒茶素、咖啡酸和香豆酸的影響很小或者幾乎沒有影響，并且保護(hù)了陳釀后葡萄酒中香氣的復(fù)雜性和新鮮度。

硫醇類物質(zhì)是葡萄酒中重要的香氣成分。在葡萄酒進(jìn)行瓶?jī)?chǔ)期間，低濃度的還原型GSH對(duì)酒中的硫醇類物質(zhì)具有保護(hù)作用?！L相思’白葡萄酒具有濃郁的水果香氣，這主要?dú)w功于其中重要的硫醇類物質(zhì)，包括4-巰基-4-甲基-2-戊酮（4-mercapto-4-methylpentan-2-one，4MMP）、3-巰基-1-己醇（3-mercaptohexan-1-ol，3MH）和3-巰基己基乙酸酯（3-mercaptohexyl acetate，3MHA），這些物質(zhì)具有黃楊木、西番蓮、葡萄柚和黑醋栗等水果的味道[83-86]。其中，3MH和Cys-3MH分別是由Cys-3MH和GSH-3MH產(chǎn)生的，4MMP是由Cys-4MMP和GSH-4MMP產(chǎn)生的[8,26,87]。乙醇發(fā)酵期間，在釀酒酵母的作用下，葡萄酒中生成了葡萄中所沒有的4MMP和3MH這兩種揮發(fā)性的硫醇。然而，在葡萄酒瓶?jī)?chǔ)期間，這些揮發(fā)性硫醇物質(zhì)逐漸消失，這是因?yàn)榱虼碱愇镔|(zhì)極易受到氧氣的影響[8,30]，一般與多酚氧化、金屬催化氧化有關(guān)。研究表明，在‘長相思’葡萄酒進(jìn)行瓶?jī)?chǔ)前，向酒中添加10 mg/L或20 mg/L的還原型GSH均能顯著提高陳釀后葡萄酒中3MH的含量[11,88]。同時(shí)添加SO2與還原型GSH也可以減緩‘長相思’葡萄酒中3MH和3MHA的降解[59]。此外，葡萄酒中的羥基肉桂酸易被氧化形成o-醌，這些醌易與硫醇發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)[8]。而還原型GSH含有的巰基組分也能與o-醌發(fā)生反應(yīng)，因此，它與硫醇之間進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，從而防止硫醇類物質(zhì)在葡萄酒瓶?jī)?chǔ)期間遭受破壞[89]。然而，Patel等[10]采用含高質(zhì)量濃度還原型GSH（67 mg/L）的葡萄汁進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵后的酒中多種硫醇類物質(zhì)含量下降，然而其下降機(jī)理并未得到解釋。

20世紀(jì)80年代末期，研究人員在德國葡萄酒中發(fā)現(xiàn)了兩種能導(dǎo)致葡萄酒貯存時(shí)產(chǎn)生異味的物質(zhì)，分別是葫蘆巴內(nèi)酯（3-羥基-4,5-二甲基-2(5H)-呋喃酮）和2-氨基苯乙酮（2-aminoacetophenone，2-AAP）[60]。前者在葡萄酒中的感官閾值為8 μg/L，具有強(qiáng)烈的咖喱味；后者在葡萄酒中的感官閾值為0.5～1.5 μg/L，若其質(zhì)量濃度高于感官閾值，會(huì)呈現(xiàn)濕羊毛、雜醇油、臭樟腦和家具擦光油的味道[90]。Dubourdieu等[60]在‘長相思’葡萄酒裝瓶前添加10 mg/L還原型GSH，將其貯存3 年后，發(fā)現(xiàn)酒中葫蘆巴內(nèi)酯含量在其感官閾值以下，酒中2-AAP含量為對(duì)照葡萄酒中的一半，從而證實(shí)了還原型GSH具有抑制這兩種物質(zhì)生成的作用，然而其作用機(jī)制并未得到闡明。

H2S是葡萄酒中具有臭雞蛋味的物質(zhì)，當(dāng)其在葡萄酒中的含量超過其感官閾值時(shí)就會(huì)嚴(yán)重影響葡萄酒的品質(zhì)。葡萄酒中H2S的含量受到葡萄醪中含硫化合物含量、酵母菌株、發(fā)酵條件、葡萄汁營養(yǎng)狀態(tài)等因素的影響[8]。研究發(fā)現(xiàn)，還原型GSH與H2S的產(chǎn)生有關(guān)，還原型GSH中的半胱氨酸殘基可在半胱氨酸脫巰基酶的作用下形成H2S。葡萄酒含有高濃度的還原型GSH或者處于低氧環(huán)境且含有二價(jià)銅離子的環(huán)境中，都會(huì)促進(jìn)H2S的產(chǎn)生[11]。Kreitman等[91]發(fā)現(xiàn)，銅離子與還原型GSH、H2S、甲硫醇（methanethiol，MeSH）共同存在時(shí)會(huì)產(chǎn)生MeSH-GSH二硫化物和MeSH-GSH三硫化物。因此，葡萄酒中含有高濃度的還原型GSH會(huì)對(duì)葡萄酒的風(fēng)味產(chǎn)生不利影響。目前，關(guān)于還原型GSH利于H2S產(chǎn)生的機(jī)理仍未得到充分闡明。針對(duì)不同葡萄原料和釀造工藝，研究者應(yīng)尋找還原型GSH的最佳添加劑量和時(shí)間，并控制H2S生成量，揚(yáng)長避短，以達(dá)到提高葡萄酒品質(zhì)的目的。

6 結(jié) 語

目前，GSH已經(jīng)得到了各國學(xué)者和釀酒師的普遍關(guān)注。GSH是葡萄和葡萄酒的內(nèi)源性抗氧化劑，也是一種安全有效的葡萄酒品質(zhì)改良劑，在保護(hù)葡萄酒色澤和風(fēng)味的同時(shí)增加了葡萄酒的營養(yǎng)。此外，提高葡萄酒內(nèi)源性還原型GSH的含量可以減少SO2的使用量，有效抑制葡萄酒氧化，避免因使用大量SO2而造成葡萄酒風(fēng)味協(xié)調(diào)性差以及產(chǎn)生不良異味的現(xiàn)象。目前，可以通過以下措施來提高葡萄和葡萄酒中還原型GSH的含量：在葡萄種植期間，采用合理的栽培措施增加葡萄果實(shí)中還原型GSH的含量；在葡萄酒釀造過程中，選擇在葡萄汁中添加還原型GSH、使用非活性干酵母或采用高產(chǎn)還原型GSH釀酒酵母進(jìn)行乙醇發(fā)酵；在葡萄酒瓶?jī)?chǔ)前，采取添加外源食品級(jí)還原型GSH的方法防止葡萄酒氧化和香氣喪失。然而，酒中含有高濃度的還原型GSH可能會(huì)促進(jìn)具有不良?xì)馕禜2S的產(chǎn)生。因此，針對(duì)不同的葡萄品種、葡萄酒類型以及釀造工藝，尋找適合的還原型GSH添加時(shí)間和劑量非常關(guān)鍵，同時(shí)未來需綜合運(yùn)用各種分析技術(shù)進(jìn)一步探索還原型GSH如何影響葡萄酒的品質(zhì)。如研究還原型GSH在乙醇發(fā)酵、MLF、貯藏過程中的變化規(guī)律；外源還原型GSH的添加時(shí)間和添加劑量對(duì)葡萄酒品質(zhì)的影響；高產(chǎn)還原型GSH釀酒酵母對(duì)葡萄酒品質(zhì)的影響；還原型GSH對(duì)葡萄酒中酚類、芳香類物質(zhì)、酵母菌及乳酸菌的影響及其作用機(jī)理；影響葡萄酒中GSH含量的因素等。這些相關(guān)研究將為還原型GSH應(yīng)用于葡萄酒的釀造提供更詳實(shí)的參考和實(shí)踐支持。