陳虹屹,劉旭峰,云 素,何曉茜,唐雪青,睢明河

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

隨著人民生活環(huán)境和飲食結(jié)構(gòu)的變化，高尿酸血癥(Hyperuricemia，HUA)的患病率呈逐年上升趨勢[1-3]。HUA是由于體內(nèi)尿酸(Uric acid，UA)生成過多或(和)排泄障礙而引起的體內(nèi)血尿酸濃度過高的代謝性疾病。HUA不僅是痛風(fēng)的病理基礎(chǔ)，而且與高血壓、肥胖、胰島素抵抗及動脈粥樣硬化密切相關(guān)[4-7]。目前，針灸治療HUA的實驗研究、機理研究很少，而且是以緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀為主要目的，忽視了對于無癥狀HUA早期的防治[8-9]。UA作為嘌呤代謝的終產(chǎn)物主要由細(xì)胞代謝分解的核酸和其他嘌呤類化合物以及食物中的嘌呤經(jīng)酶的作用分解而來。黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase，XOD)、腺苷脫氨酶 (Adenosinedeaminase，ADA)及鳥嘌呤脫氨酶(Guanine deaminase，GD)是嘌呤分解途徑上的關(guān)鍵代謝酶，其活性直接或間接影響UA的生成速度[10]。本研究將觀察針刺肝俞、太沖穴對HUA 大鼠XOD、ADA、GD活性的變化，探究肝俞、太沖穴對大鼠HUA尿酸生成機制的影響，闡釋針灸防治HUA的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(180±20)g，SPF級，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2016-0006。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，分籠飼養(yǎng)，4只一籠，自由飲水、飲食。飼養(yǎng)溫度18～25℃，濕度55%～65%，12 h光照/黑暗交替循環(huán)。按隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、腎俞組及肝俞組，每組8只。實驗中對動物的處理符合中華人民共和國科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。因在飼養(yǎng)和干預(yù)治療過程中，各組大鼠均出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，最后納入統(tǒng)計空白組和肝俞組各6只、模型組和腎俞組各7只。

1.2 主要試劑與儀器

氧嗪酸鉀(源葉生物，純度：98%，批號：Y26O8C46573);XOD檢測試劑盒(批號：A002-1)、ADA檢測試劑盒(批號：A048-1)、GD ELISA檢測試劑盒(批號：A079-2)均為南京建成生物工程研究所生產(chǎn);Anti-Xanthine Oxidase抗體(abcam，批號：ab109235)。

無菌針灸針(規(guī)格：0.30×13 mm，環(huán)球牌，批號：170701);低溫離心機(5810R，德國Eppendord公司);超低溫冰箱(MDF-U50V，日本三洋公司);多功能酶標(biāo)儀(PerkinElmer EnSpire);漩渦混勻器、恒溫水浴箱(美國Thermo);微量移液器、臺式離心機(eppendorf);超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng) (Bio-Rad ChemiDoc XRS+);石蠟組織切片機、顯微鏡、相機(Lecai);Image Pro Plus軟件(美國Media Cybernetics公司)。

1.3 造模方法

空白組大鼠灌胃10 mL/kg生理鹽水，其余組大鼠按10 mL/kg灌胃給予氧嗪酸鉀2 g/(kg·d)構(gòu)建HUA模型，每日1次。模型評價標(biāo)準(zhǔn)：10天后大鼠眼眶后靜脈叢取血，用全自動生化儀測定血清尿酸(SUA)水平，與空白組對比，SUA明顯升高(P<0.05),則證明造模成功。針刺干預(yù)時為維持高尿酸指標(biāo)，各組將改為隔天灌胃1次。

1.4 干預(yù)方法

空白組：同步正常喂養(yǎng)，不予任何操作。

模型組：針刺時用鼠袋束縛20 min,每天1次，6次后休息1天，持續(xù)3周。

腎俞組：大鼠俯臥位以鼠袋固定于操作臺上，按照大鼠針灸穴位圖譜及比較解剖學(xué)方法取穴，針刺腎俞、太溪穴，直刺3～5 mm，捻轉(zhuǎn)10 s，捻轉(zhuǎn)角度為180°，100 r/min,留針20 min，以針柄震顫、動物保持安靜不掙扎嘶叫為度，其余同模型組。

肝俞組：針刺肝俞、太沖穴，其余同腎俞組。

穴位定位：腎俞穴：第2、3腰椎棘突間，旁開1.5 cm處;太溪穴：內(nèi)踝與跟結(jié)節(jié)之間凹陷中;肝俞穴：第9、10胸椎棘突間，旁開1.5 cm處;太沖穴：后肢足背第1至第2跖骨間凹陷處[11]。

1.5 觀察指標(biāo)與檢測方法

1.5.1 檢測大鼠SUA 第32天治療結(jié)束后，將每組大鼠予10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，開腹，腹主動脈取血2～4 mL，放入離心管，靜置1 h，促其凝固。30 min內(nèi)4℃1 000 r/min離心15 min后取上清液放入全自動生化儀檢測。

1.5.2 比色法檢測肝勻漿中XOD、ADA的活性 打開腹腔，摘取肝臟，取大鼠肝臟同一部位部分組織，用生理鹽水按重量體積比制備成組織勻漿液，離心取上清液。按照試劑盒說明書步驟加入樣本和試劑，漩渦混勻，在37℃恒溫水浴箱中孵育，靜置，加入終止液，比色。

1.5.3 免疫組化法(IHC)檢測肝組織XOD受體免疫物陽性相對表達(dá)量 將處死后各組大鼠的肝臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定液固定后,4℃保存，常規(guī)石蠟包埋，制作成厚4 μm的切片，經(jīng)過脫蠟后，將組織放置在切片架上，放入燒杯，加入足夠的檸檬酸鹽，微波爐加熱，直至沸騰。間斷加熱，保持水溫在95～99℃左右15 min。取出燒杯，室溫冷卻40 min左右至室溫。然后PBS洗滌，甩干水，劃蠟圈，放入3%H2O2中，室溫封閉10 min。再用PBS洗滌，用PBST配制的10%FBST37℃封閉1 h。用含3%FBS的PBST稀釋一抗，再組織上滴加稀釋好的一抗，4℃冰箱孵育過夜，然后滴加二抗孵育1 h。孵育完成后，用PBS洗滌，滴加DAB工作液顯色后放入水中終止，再用PBS洗滌后，滴加蘇木素染核、酒精鹽酸分色，再脫水，最后用中性樹脂將二甲苯透明后的組織進行鋪片固定，LEICA照相機拍照(200×)。

1.5.4 酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測肝勻漿中GD的含量 切割肝臟標(biāo)本后，稱取重量,加入一定量的PBS，Ph7.4,用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?標(biāo)本融化后仍然保持2～8℃的溫度,加入一定量的PBS(Ph7.4)，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,2 000～3 000 r/min，離心20 min左右,仔細(xì)收集上清,分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。采用競爭法檢測樣本中GD的含量,向預(yù)先包被了抗體的酶標(biāo)孔中加入樣本，再加入生物素標(biāo)記的識別抗原，在37℃下孵育30 min，兩者與固相抗體競爭結(jié)合形成免疫復(fù)合物，經(jīng)PBST洗滌除去未結(jié)合的生物素抗原，然后加入親和素-HRP，在37℃下孵育30 min，親和素-HRP與生物素抗原結(jié)合，洗滌后結(jié)合的HRP催化TMB(四甲基聯(lián)苯胺)成藍(lán)色，隨后在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色，在450 nm波長下有吸收峰，吸光值與樣本中抗原的濃度成負(fù)相關(guān)。按樣品讀數(shù)及樣品稀釋濃度計算出肝勻漿GD的濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理方法

2 結(jié)果

第32天時SUA檢測，腎俞組有1樣本可能因取材時被污染，全自動分析儀未讀出數(shù)據(jù)結(jié)果，血清樣本最終納入統(tǒng)計的是空白組、腎俞組及肝俞組，各6例，模型組7例。IHC檢測，模型組與腎俞組各有1樣本拍照顯示染色失敗，肝組織樣本最終納入統(tǒng)計為各組6例。ELISA檢測，數(shù)據(jù)用格拉布斯法檢驗發(fā)現(xiàn)有異常值，故剔除異常數(shù)據(jù)樣本，肝勻漿樣本最終納入統(tǒng)計是空白組5例、模型組和腎俞組7例、肝俞組6例。

2.1 各組大鼠血清SUA水平比較

第10天時，與空白組比較其余組SUA水平升高(P<0.01),說明HUA大鼠模型造模成功。第32天時，與空白組比較模型組SUA水平升高(P<0.01)；與模型組比較腎俞組和肝俞組SUA水平降低(P<0.01)，證明針刺干預(yù)可以有效降低SUA水平。見表1。

表1 各組大鼠SUA水平

注：與空白組比較，▲▲P<0.01；與模型組比較，●●P<0.01。

2.2 各組大鼠肝勻漿XOD活性的比較

與空白組比較，模型組XOD活性顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較，腎俞組和肝俞組XOD活性降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠XOD、ADA、GD、XOD受體免疫反應(yīng)物水平比較

注：與空白組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較，●●P<0.01；與腎俞組比較，○P<0.05。

2.3 各組大鼠XOD受體免疫反應(yīng)物陽性相對表達(dá)情況比較

與空白組比較，模型組大鼠肝臟XOD受體免疫反應(yīng)物陽性相對表達(dá)水平升高(P<0.01)；與模型組比較，腎俞組和肝俞組XOD受體免疫反應(yīng)物陽性表達(dá)顯著減弱(P<0.01)；與腎俞組比較，肝俞組XOD受體免疫反應(yīng)物陽性表達(dá)水平下降(P<0.05)。見封三圖1、表2。

2.4 各組大鼠肝勻漿ADA活性比較

與空白組比較，模型組大鼠ADA的活性升高(P<0.05),腎俞組和肝俞組ADA活性降低(P<0.05或P<0.01);與模型組比較，腎俞組和肝俞組ADA的活性降低(P<0.01)。見表2。

2.5 各組大鼠肝勻漿GD濃度比較

與空白組比較，模型組GD的濃度升高(P<0.01)；與模型組比較，腎俞組GD的濃度呈下降趨勢(P>0.05)，肝俞組GD的濃度顯著降低(P<0.01)。見表2。

3 討論

3.1 肝俞、太沖配穴對肝臟的調(diào)節(jié)作用

古代中醫(yī)文獻(xiàn)沒有與HUA完全對應(yīng)的病名，但與痛風(fēng)關(guān)系密切。從《內(nèi)經(jīng)》“治未病”思想來看，HUA為“痛風(fēng)之微”，或為“痛風(fēng)之未病狀態(tài)”。HUA患者早期雖然常無特殊不適主訴，但?？梢婓w型肥胖、納呆便溏及舌質(zhì)胖大等特點。中醫(yī)辨證肝腎虧虛、脾失健運為本，痰濁瘀阻為標(biāo)[12]。目前，尚無對HUA有效的治療方法，因此對HUA的早期防治尤為重要，而針灸在HUA的預(yù)防與治療中顯示了獨特而顯著的優(yōu)勢。肝俞，肝之背俞穴，是肝之氣血輸注于腰背之處；太沖，足厥陰肝經(jīng)之原穴，是肝之原氣留止的部位。肝俞、太沖穴都可治療肝臟的疾病，二者同用能相互協(xié)同增強療效[13]，對肝之虛實都有調(diào)節(jié)作用，有補益肝腎、疏肝理氣之效。

3.2 大鼠肝臟XOD、ADA、GD對UA生成的影響

UA是嘌呤物質(zhì)的分解產(chǎn)物，UA的來源分為內(nèi)源性和外源性,外源性UA來源于食物,占體內(nèi)UA來源的20%;內(nèi)源性UA源于體內(nèi)氨基酸、磷酸核糖及其他小分子合成和核酸分解代謝,主要是肝臟生成的，占體內(nèi)UA來源的80%,是UA生成的主要場所。UA生成過多的內(nèi)源性因素主要表現(xiàn)在酶缺陷引起的嘌呤合成活躍[14]。

嘌呤核苷酸的分解代謝一般先在單核苷酸酶催化下水解生成嘌呤核苷，包括腺嘌呤核苷和鳥嘌呤核苷，其中腺嘌呤核苷繼續(xù)在ADA的催化下生成次黃嘌呤核苷。次黃嘌呤核苷和鳥嘌呤核苷在嘌呤核苷磷酸化酶的催化下，分別轉(zhuǎn)化成次黃嘌呤和鳥嘌呤。其中次黃嘌呤在XOD催化下轉(zhuǎn)變成黃嘌呤，而鳥嘌呤在GD的催化下也轉(zhuǎn)變成黃嘌呤。黃嘌呤繼續(xù)在XOD催化下進一步被氧化成UA。在UA的生成過程中，雖然大部分都是由次黃嘌呤、黃嘌呤在XOD的作用下降解而來,但仍有少量是通過GD降解鳥嘌呤產(chǎn)生的[15]?？梢奨OD、ADA、GD的變化與人體內(nèi)UA水平密切相關(guān)。見圖2。

圖2 體內(nèi)尿酸生成圖

3.3 針刺肝俞、太沖穴對HUA大鼠XOD、ADA、GD的影響

以前普遍認(rèn)為，90%的HUA是由UA排泄減少引起的，而不是生成過多。然而，最近的臨床試驗證明,刺激UA排泄只成功降低約67%患者的SUA水平，而聯(lián)合XOD抑制劑治療可以產(chǎn)生高達(dá)100%的有效率[16-17]。這說明抑制UA生成是治療HUA的重要環(huán)節(jié)。

3.3.1 對HUA大鼠XOD的影響 本研究觀察到,與模型組相比，肝俞組和腎俞組SUA水平顯著降低，說明針刺干預(yù)能有效降低SUA，可作為預(yù)防和防治HUA的一種手段。實驗結(jié)果顯示，針刺干預(yù)能有效抑制大鼠肝勻漿中XOD的活性，肝俞組XOD陽性相對水平的表達(dá)低于腎俞組，說明針刺肝俞、太沖穴可能直接作用嘌呤分解代謝途徑，抑制XOD代謝酶活性,使次黃嘌呤轉(zhuǎn)變成黃嘌呤減少，間接減少了UA的生成,同時干預(yù)了黃嘌呤氧化成UA最后一個過程,直接減少了UA的生成。

3.3.2 對HUA大鼠ADA的影響 實驗結(jié)果顯示,與模型組比較，針刺干預(yù)能降低ADA的活性。說明針刺肝俞、太沖穴能抑制ADA活性，減少腺嘌呤核苷轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤核苷，最終影響UA的生成。與空白組比較，腎俞組和肝俞組ADA活性降低(P<0.05，P<0.01)，產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因可能是ADA還參與ATP核酸和嘌呤堿的分解，因此能直接或間接影響核酸及能量代謝，針刺干預(yù)可能抑制核酸及能量代謝，所以ADA的活性降低。

3.3.3 對HUA大鼠GD的影響 研究發(fā)現(xiàn)，在肝臟疾病中的應(yīng)用中，血清GD測定對肝損害的早期診斷及預(yù)后判斷有較高的特異性，現(xiàn)已作為肝臟疾病的診斷指標(biāo)之一[18]。本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，肝俞組能顯著降低HUA大鼠GD的濃度，腎俞組降低GD的濃度不明顯(P>0.05)，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明針刺肝俞、太沖穴能有效抑制GD的生成，減少鳥嘌呤降解成黃嘌呤，最終減少UA的生成。

4 結(jié)論

針刺腎俞、太溪穴和肝俞、太沖穴都能降低HUA大鼠XOD、ADA的活性，且針刺肝俞、太沖穴抑制HUA大鼠XOD的效果更明顯，還能降低GD的活性，這可能與抑制了嘌呤分解代謝途徑，從而減少了尿酸的生成有關(guān)。