高建 林圣 張倩 林潔 張玲華 谷學英 邵豪 姚克勤 段山

在體外培養(yǎng)細胞的過程中，經(jīng)常需要判斷細胞在某些條件下是否能正常生長以及存活率的問題，這就涉及到對細胞活性的檢測，也是細胞增殖、細胞毒性試驗、抗腫瘤藥物篩選以及其它相關研究的基礎[1，2]。目前，有關細胞活性的檢測方法很多，基于吸光度或發(fā)光檢測的商品化試劑盒亦有很多，市場上常見的有CCK-8、alamarBlue 和CellTiter-Glo等[3～5]，三種常用試劑該如何選擇、各自有何特點是相關學者較為關心的問題，另外，對以上幾種試劑用于兩種不同類型細胞的檢測參數(shù)和綜合性能評估的報道亦較少。本研究選取代表貼壁細胞類型的人子宮頸癌細胞株Hela 和代表懸浮細胞類型的人彌漫性大B 細胞淋巴瘤細胞株SU-DHL-2 為研究對象，對以上三種試劑分別從接種細胞數(shù)目、孵育時間和檢測線性范圍等方面進行研究，期望為學者提供有價值的實踐參考。

1 材料與方法

1.1 一般資料人子宮頸癌細胞株Hela 和人彌漫性大B 細胞淋巴瘤細胞株SU-DHL-2 購自于美國ATCC 細胞資源中心；Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）購自于日本DOJINDO 公司；CellTiter-Glo?Luminescent Cell Viability Assay（簡稱CellTiter-Glo）、GLOMAX Multi Detection System 多功能酶標儀購自于美國Promega 公司；alamarBlue?Cell Viability Reagent（簡稱alamarBlue）、Gibco?熱滅活胎牛血清FBS、Gibco?DMEM 培養(yǎng)基、Gibco?RPMI-1640 培養(yǎng)基、Gibco?Trypsin-EDTA（0.25%）和CO2培養(yǎng)箱購自于美國Thermo 公司；10cm2細胞培養(yǎng)皿、96孔透明和不透明細胞培養(yǎng)板購自于美國Corning 公司；血球計數(shù)板購自于上海市求精生化試劑儀器有限公司；熒光倒置顯微鏡購自于美國Leica 公司。

1.2 研究方法

1.2.1 CCK-8 檢測方法 細胞鋪板：對于Hela，將處于對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化計數(shù)后，用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基將細胞調(diào)整到一定密度，接種到96 孔透明細胞培養(yǎng)板中，使每100μl 細胞懸液中的細胞數(shù)目分別為0、2 000、4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 和14 000個/孔；對于SU-DHL-2，將處于對數(shù)生長期的細胞吹散混勻計數(shù)后，用含10%FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基將細胞調(diào)整到一定密度，接種到96 孔透明細胞培養(yǎng)板中，使每100μl細胞懸液中的細胞數(shù)目分別為0、4 000、8 000、12 000、16 000、20 000、24 000 和28 000 個/孔；每種細胞數(shù)目設4 個復孔，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)4h。線性范圍確定：向預培養(yǎng)后的細胞中，每孔加入10μl CCK-8，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1～4h，每隔1h 用多功能酶標儀檢測450nm 波長處的吸光度；根據(jù)平均吸光度值，繪制吸光度隨細胞和時間的變化曲線，去掉處于平臺期的平均吸光度值后，進行Pearson 線性相關分析，確定可檢測細胞數(shù)線性范圍。

1.2.2 alamarBlue 檢測方法 細胞鋪板：方法同1.2.1。線性范圍確定：向預培養(yǎng)后的細胞中，每孔加入10μl alamarBlue，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1～8h，每隔1h 用多功能酶標儀檢測560nm 波長處的吸光度；根據(jù)平均吸光度值，繪制吸光度隨細胞和時間的變化曲線，去掉處于平臺期的平均吸光度值后，進行Pearson 線性相關分析，確定可檢測細胞數(shù)線性范圍。

1.2.3 CellTiter-Glo 檢測方法 細胞鋪板：將處于對數(shù)生長期的Hela 和SU-DHL-2 計數(shù)后，分別用含10%FBS 的DMEM培養(yǎng)基和含10%FBS 的RPMI- 1640 培養(yǎng)基將細胞調(diào)整到一定密度，接種到96 孔不透明細胞培養(yǎng)板中，使每100μl 細胞懸液中的細胞數(shù)目分別為0、6 250、12 500、25 000 和50 000個/孔，每種細胞數(shù)目設4 個復孔，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)4h。線性范圍確定：將CellTiter-Glo 的緩沖液室溫溶解后倒入裝有底物凍干粉的棕色瓶中混勻，將預培養(yǎng)后的細胞培養(yǎng)板拿出，在室溫下平衡30min，然后向每孔中加入100μl 檢測試劑，在多功能酶標儀上設置參數(shù)：震蕩混勻2min，孵育10min，檢測發(fā)光信號值（RLT）；根據(jù)平均發(fā)光信號值，如有處于平臺期的發(fā)光信號值則舍棄，然后進行Pearson 線性相關分析，確定可檢測細胞數(shù)線性范圍。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有結(jié)果均采用SPSS Statistics 22軟件進行分析，當4 個復孔的結(jié)果存在離群值時剔除該值后再進行平均值計算，以平均吸光度值或平均發(fā)光信號值作為縱坐標，每孔接種細胞數(shù)目作為橫坐標，進行Pearson 線性相關分析。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8 的檢測結(jié)果 對于Hela 和SU-DHL-2兩種細胞，吸光度值都會隨著接種細胞數(shù)的增多和孵育時間的延長而均勻增加，隨后進入平臺期，增幅變得越來越?。ㄒ妶D1A 和圖1C）。對于Hela細胞，接種數(shù)在0～8 000 之間、孵育時間為1h 時線性相關性最好，Pearson 相關系數(shù)r為0.997（見圖1B）；對于SU-DHL-2 細胞，接種數(shù)在0～28 000之間、孵育時間在1h 或2h 時線性關系比較好，Pearson 相關系數(shù)r均為0.995（見圖1D）。

2.2 alamarBlue 的檢測結(jié)果 對于Hela 細胞，當孵育時間≤5h、接種細胞數(shù)≤2 000 時，試劑尚未發(fā)生還原反應，導致背景吸光度值比接種細胞孔的值高或接近（見圖2A），當繼續(xù)孵育至6h、7h 時才能取得非常好的線性，Pearson 相關系數(shù)r均為0.996（見圖2B）；對于SU-DHL-2 細胞，吸光度值隨著接種細胞數(shù)的增多和孵育時間的延長增加得非常明顯，但很快進入平臺期（見圖2C）；孵育時間在2h 時的線性關系最好，Pearson 相關系數(shù)r為0.998（見圖2D）。

圖1 CCK-8 用于Hela 和SU-DHL-2 細胞活性的檢測及線性范圍

圖2 alamarBlue 用于Hela 和SU-DHL-2 細胞活性的檢測及線性范圍

2.3 CellTiter-Glo 的檢測結(jié)果 對于Hela 和SUDHL-2 兩種不同類型的細胞，當接種細胞數(shù)在0～50 000 之間時，平均發(fā)光信號值和細胞數(shù)之間均表現(xiàn)出非常好的線性，Pearson 相關系數(shù)均達到了0.999，可檢測細胞線性范圍較寬（見圖3）。

2.4 三種試劑的最佳檢測條件 三種試劑都可用于兩種不同類型細胞Hela 和SU-DHL-2 的檢測，在可檢測細胞數(shù)線性范圍和最佳孵育時間方面均有所不同，可根據(jù)自身的研究需要從中選擇合適的試劑和檢測參數(shù)，見表1。

圖3 CellTiter-Glo 用于Hela 和SU-DHL-2 細胞活性的檢測及線性范圍

表1 三種試劑檢測兩種細胞的最佳條件

3 討論

在體外細胞實驗中，常涉及到對細胞增殖和細胞活性的檢測，尤其是在細胞增殖、細胞毒性以及細胞對藥物敏感度的量化研究方面。在實際操作過程中，可以通過多種方法檢測所培養(yǎng)細胞的健康狀況，如質(zhì)膜完整性、DNA 合成、酶活性、ATP 以及代謝活性等，可作為細胞存活和死亡的指標[6～8]。本次研究所選用的三種試劑的檢測原理均是基于以上公認的指標之一。CCK-8 和alamarBlue 的原理相似，都是在活細胞線粒體酶的作用下，將底物還原為有顏色的水溶性產(chǎn)物，通過檢測有色產(chǎn)物的吸光度來間接反映活細胞的數(shù)量[9，10]；CellTiter-Glo 是一種通過對ATP 進行定量測定來反映活細胞數(shù)目的方法，它采用熒光素酶作檢測物，發(fā)光信號的強弱與體系中ATP 的量成正比，而ATP 的量又與活細胞的數(shù)目呈正相關，因為體系中的ATP 只能來源于活細胞的新陳代謝[11，12]。

實驗操作方面，對于CCK-8 和alamarBlue 兩種試劑，在檢測時都是直接加入到培養(yǎng)基中混勻即可，孵育結(jié)束后直接用酶標儀檢測吸光度，無需裂解細胞，細胞在檢測完畢后還可以繼續(xù)培養(yǎng)或用于其它實驗；由于CCK-8 的顏色與含酚紅的培養(yǎng)基比較接近，應盡量避免漏加或多加的情況；而alamarBlue 加入培養(yǎng)基后溶液立刻變成藍色，很容易區(qū)分，但是當細胞濃度過高或孵育時間過長時，會導致繼發(fā)性還原反應，進而使有色產(chǎn)物顏色消失，整個操作過程還應嚴格避光，并且保證無菌操作，因為微生物污染物同樣可以還原檢測試劑而影響實驗結(jié)果[13]；對于CellTiter-Glo 試劑，將底物凍干粉和緩沖液混勻平衡至室溫后，與培養(yǎng)基等體積加入，混勻孵育10min 后即可檢測，也不受培養(yǎng)基中酚紅和有機溶劑的影響，但是細胞不可用于后續(xù)實驗，因為在孵育過程中被充分裂解，檢測時必須用不透明的培養(yǎng)板和配套發(fā)光檢測設備。

在檢測結(jié)果方面，以上三種試劑都可同時用于貼壁細胞和懸浮細胞的增殖和活性測定，在一定范圍的細胞數(shù)目和孵育時間內(nèi)，均能表現(xiàn)出很好的線性關系，Pearson 相關系數(shù)均在0.99 以上。對于CCK-8 試劑，在最佳孵育時間均為1h 的情況下，懸浮細胞SU-DHL-2 的檢測線性范圍遠大于貼壁細胞Hela；對于alamarBlue 試劑，兩種細胞的檢測線性范圍相當，但是孵育時間卻存在較大差別，對于貼壁細胞，需要較長的孵育時間；對于CellTiter-Glo 試劑，兩種細胞的結(jié)果表現(xiàn)一致，檢測的線性范圍較寬，孵育時間只需要10min，相關性也是最好，由于加樣體積的增大和光信號自身的特性，大大降低了系統(tǒng)誤差，使得結(jié)果的準確性和重復性都較高[14]。

綜上所述，三種試劑在一定的條件下，均能取得令人滿意的結(jié)果。對于CCK-8 和alamarBlue 兩種試劑，實驗操作最為簡單，屬于即開即用型，成本也相對較低，檢測后的細胞經(jīng)洗滌可重復使用，可進行后續(xù)的細胞活力檢測、細胞周期分析或與增殖有關的細胞表面抗體測定等，缺點是需要耗費較長時間來摸索最佳檢測條件，CCK-8 對貼壁細胞的檢測線性范圍較窄，alamarBlue 對貼壁細胞的孵育時間較長，二者對懸浮細胞的檢測效果較好；對于CellTiter-Glo 試劑，操作時需要先行解凍并平衡至室溫后使用，需要配套儀器來混勻和檢測發(fā)光信號，整體成本較高，因細胞在檢測過程中被裂解而不可用于后續(xù)實驗，但是該試劑孵育時間僅需要10min，對兩種類型細胞的線性檢測范圍較寬，對細胞數(shù)目要求不嚴格，自動化程度較高，尤其適合大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選以及細胞毒性試驗等，檢測效率、靈敏度和準確性均較好。