姜雪梅，錢越，戴紅良

（錦州醫(yī)科大學 1. 附屬第一醫(yī)院消化科； 2. 附屬第一醫(yī)院變態(tài)反應與臨床免疫研究中心； 3. 護理學院社區(qū)護理學教研室，遼寧 錦州 121001）

肺癌在我國發(fā)病率極高。據統計，我國每年約有52萬肺癌新發(fā)病例出現，死亡率為45萬/年。其中，超過80%的晚期肺癌屬于非小細胞肺癌［1］。盡管過去的20年間，人們對于肺癌有了更加充分的理解，但肺癌患者的5年生存率仍然很低［2］。染料木黃酮是大豆中重要的植物化學物，具有較強的酪氨酸激酶抑制活性［3-4］。近年來，染料木黃酮的抗癌作用備受關注。研究顯示，染料木黃酮可抑制結腸直腸癌［5］、肝癌［6］、乳腺癌［7］及口腔癌［3］等多種癌細胞的增殖。也有研究［8-9］顯示，染料木黃酮對肺癌細胞的增殖具有顯著的抑制作用。本研究擬觀察染料木黃酮對非小細胞肺癌PC14細胞增殖的影響，并對其作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

染料木黃酮 （純度99.1%，中國藥品生物制品檢定所），DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清 （美國Thermo Fisher Scientific公司），二甲基亞砜、噻唑藍、結晶紫、PD98059、SB203580、SP600125 （美國Sigma公司），p-ERK抗體 （沈陽萬類生物科技有限公司），JNK，p-JNK和ERK抗體 （美國Abcam公司），辣根過氧化物酶標記二抗 （美國Santa Cruz公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司），倒置顯微鏡 （德國LEICA公司），潔凈工作臺 （青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司），酶標儀 （美國Thermo Fisher Scientific公司），電泳儀及轉膜儀 （美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：人非小細胞肺癌PC14細胞購自中國科學院上海細胞庫。細胞以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃，5% CO2飽和濕度條件下進行培養(yǎng)。0.25% EDTA胰酶消化傳代，待細胞處于對數生長期時進行實驗處理。

1.2.2 細胞增殖檢測：將對數生長期的PC14細胞接種于96孔板，培養(yǎng)過夜，每孔分別加入0、2.5、5、10、20 mg/L染料木黃酮繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。藥物作用結束后，每孔加入5 g/L的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，隨后以150 μL DMSO充分溶解甲臜后，在570 nm波長處測定每孔吸光度值。

1.2.3 細胞集落形成實驗：將PC14細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔600個細胞，培養(yǎng)過夜后，每孔加入0、2.5、5、10、20 mg/L染料木黃酮繼續(xù)培養(yǎng)10 d，隨后棄去培養(yǎng)液并用PBS沖洗3遍，4%多聚甲醛固定后結晶紫染色并拍照。

1.2.4 蛋白提取和免疫印跡：收集細胞，加入含0.1% PMSF的RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白。蛋白經10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉移至聚偏氟乙烯膜。以新鮮配置1% BSA室溫下封閉1 h，TBST洗膜后，加入用TBST稀釋的一抗4 ℃孵育過夜。用TBS-T充分洗去非特異結合的抗體后，室溫下用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2 h。TBS-T充分洗滌后，ECL顯色后經凝膠成像儀成像分析。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 染料木黃酮對PC14細胞增殖的影響

不同濃度染料木黃酮處理PC14細胞24、48和72 h后，細胞增殖隨著藥物濃度的增加和時間的延長，呈現出明顯的下降趨勢；集落形成實驗也顯示，染料木黃酮可劑量依賴性地抑制PC14細胞集落的形成，見表1，圖1。

2.2 MAPK抑制劑對PC14細胞增殖的影響

表1 染料木黃酮對PC14細胞生長的抑制作用 （±s，n = 6）Tab.1 Inhibitory effects of genistein on PC14 cell growth （±s，n = 6）

表1 染料木黃酮對PC14細胞生長的抑制作用 （±s，n = 6）Tab.1 Inhibitory effects of genistein on PC14 cell growth （±s，n = 6）

1） P < 0.05 vs control group at the same time point.

Optical density 24 h 48 h 72 h Control 0.21±0.02 0.36±0.03 0.47±0.02 Genistein 2.5 mg/L 0.22±0.03 0.36±0.02 0.46±0.05 Genistein 5 mg/L 0.22±0.01 0.37±0.02 0.33±0.051）Genistein 10 mg/L 0.20±0.02 0.35±0.03 0.21±0.041）Genistein 20 mg/L 0.22±0.03 0.26±0.031） 0.11±0.021）Group

ERK特異性阻斷劑PD98059、p38MAPK特異性阻斷劑SB203580及JNK特異性阻斷劑SP600125可使對照組MTT吸光度值由0.49分別下降至0.36、0.28及0.22。表明這3個MAPK分子在PC14細胞中均起到促進增殖的作用。

2.3 染料木黃酮對PC14細胞MAPK信號通路的影響

PC14細胞經不同濃度染料木黃酮處理后，p-p38MAPK蛋白的表達不受藥物影響，而p-ERK及p-JNK的水平均隨著藥物濃度的增加而逐漸減弱，見圖2。

3 討論

圖1 染料木黃酮對PC14細胞增殖的影響Fig.1 Effects of genistein on PC14 cell proliferation

圖2 染料木黃酮對PC14細胞ERK及JNK通路的影響Fig.2 Effect of genistein on the ERK and JNK pathways in PC14 cells

近年來，天然物質高效低毒的特性受到藥物研究人員的廣泛關注。染料木黃酮是存在于大豆等植物中的天然異黃酮類非營養(yǎng)物質。研究［3-4］證實，該物質具有抑制平滑肌源性泡沫細胞的形成、抑制星形膠質細胞水腫及抗腫瘤等多種生物活性。研究［3］顯示，染料木黃酮對多種腫瘤細胞的生長均顯示出強大的抑制作用，而其對非小細胞肺癌作用和機制的研究尚處于初步階段。本研究證實，染料木黃酮能顯著抑制非小細胞肺癌PC14細胞的增殖，這與凌藝輝等［10］（H1299細胞） 及崔俊英等［11］（H1975） 報道的結果類似。同時，相較口腔癌TCA8113細胞，PC14細胞對染料木黃酮似乎更為敏感，2.5 mg/L的染料木黃酮即可顯著降低肺癌細胞增殖［3］。

MAPKs屬絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，主要包括ERK、JNK和p38MAPK 3個家族成員，在調節(jié)細胞增殖、分化、遷移、侵襲、炎癥、死亡等多種生物學過程中都起著極為重要的作用［12］。但隨著細胞類型、刺激條件、刺激時程等的不同，MAPKs家族既可以誘導細胞的增殖，又可能導致其死亡［12-13］。本研究發(fā)現，MAPKs特異性抑制劑可顯著抑制PC14細胞的增殖，表明MAPKs分子的活化對于PC14細胞的增殖是不可或缺的。與此同時，本研究還證實染料木黃酮可顯著抑制ERK及JNK的活化。基于上述結果，染料木黃酮對PC14細胞的增殖抑制活性與其對ERK及JNK的抑制有關。

肺癌在世界范圍內發(fā)病率和死亡率都很高，臨床上的治療手段目前主要有手術、放療和化療等，但目前的化療藥物一般不良反應都較大，且其療效有限［14-15］。因此，開發(fā)新型高效低毒的抗肺癌藥物仍然是擺在藥物工作者面前的一項重任。本研究證實，染料木黃酮可通過調控ERK和JNK的活化抑制肺癌細胞的增殖，染料木黃酮屬于天然活性化合物，與傳統化療藥物相比，其療效確切、來源廣泛、價格低廉、不良反應小，有望成為臨床上治療肺癌的新選擇。