劉剛，周建平，李新，董明

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科/疝與腹壁外科，沈陽 110001）

結(jié)直腸癌 （colorectal cancer，CRC） 是全球第三大常見癌癥，每年約有120萬新發(fā)病例，約有60萬人死于該?。?］。炎性腸病包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，主要以慢性腸道炎癥為特征，常常導(dǎo)致腹痛、腹瀉和便血［2］。結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌在炎性腸病患者中具有較高的發(fā)病率，這類腫瘤不同于無炎癥結(jié)腸中散發(fā)腫瘤，其死亡率更高［3］。表沒食子兒茶素沒食子酸酯 （epigallocatechin gallate，EGCG） 是兒茶素的一種，近期有研究［4］顯示EGCG具有抑制CRC細(xì)胞增殖的作用，WUBETU等［5］的一項(xiàng)研究顯示，EGCG能夠通過抑制p-AKT、Nek2蛋白活性，調(diào)節(jié)AKT通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞死亡，而GUAN等［6］的研究證實(shí)EGCG并無抗腫瘤作用，而且高劑量的EGCG還會促進(jìn)腫瘤發(fā)生。高毒致癌物氧化偶氮甲烷 （azoxymethane，AOM） 聯(lián)合致炎劑葡聚糖硫酸鈉 （dextran sulfate sodium，DSS） 構(gòu)建小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型或結(jié)腸炎相關(guān)性CRC模型已有報(bào)道［7-8］。本研究通過AOM/DSS方式在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)小鼠結(jié)直腸腫瘤生成，并給予EGCG干預(yù)，觀察其對小鼠腫瘤發(fā)生的影響，進(jìn)一步通過免疫組化檢測AOM/DSS和AOM/DSS+EGCG處理的小鼠結(jié)直腸組織中CD31和CD68的表達(dá)，并探討EGCG在結(jié)直腸腫瘤發(fā)生過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

30只5周齡雌性BALB/c小鼠 （北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司） 于中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部隔離檢疫，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度 （25±2）℃；濕度 （50±5） %；照明12 h、黑暗12 h交替。將小鼠隨機(jī)分為對照組、AOM/DSS組和AOM/DSS+EGCG組，每組10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

AOM （美國Sigma公司） ；DSS （美國MP生物醫(yī)學(xué)公司） ；EGCG （上海麥克林生化科技有限公司） ；CD31抗體 （英國Abcam公司） ；CD68抗體 （美國NOVUS公司） ；即用型免疫組化超敏試劑盒、檸檬酸組織抗原修復(fù)液以及PBS磷酸鹽緩沖液 （福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司） 。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物模型的建立：實(shí)驗(yàn)起始時(shí)AOM/DSS組和AOM/DSS+EGCG組小鼠腹腔注射0.1% AOM （10 mg/kg） ，對照組小鼠腹腔注射生理鹽水 （10 mg/kg） 。普通飲用水飼養(yǎng)1周；第2周AOM/DSS組和AOM/DSS+EGCG組小鼠給予2% DSS飲用水喂養(yǎng)；第3、4周AOM/DSS+EGCG組小鼠給予0.01% EGCG飲用水喂養(yǎng)，AOM/DSS組用普通飲用水喂養(yǎng)。AOM/DSS組以1周DSS+2周普通飲用水為一個循環(huán)，AOM/DSS+EGCG組小鼠以1周DSS+2周EGCG為一個循環(huán)，每組重復(fù)3個循環(huán)后繼續(xù)普通飲用水喂養(yǎng)3周。對照組不做處理，全程普通飲用水喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)起始后每天觀察小鼠攝食量、飲水量、生命狀態(tài)和死亡情況，每周記錄小鼠體質(zhì)量變化。

1.3.2 標(biāo)本采集和診斷：第13周末將3組小鼠以CO2法處死，解剖分離小鼠回盲部至肛門整條腸管，延縱軸剖開，觀察腸黏膜損傷程度和腫瘤生成情況，記錄息肉及腫瘤的數(shù)量及大小。取材大腸后置于10%福爾馬林溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色。組織學(xué)改變由專業(yè)病理學(xué)醫(yī)生診斷。

1.3.3 免疫組織化學(xué)：采用SP法，將組織切片常規(guī)脫蠟和水化，檸檬酸抗原組織修復(fù)液高壓修復(fù)，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育20 min，動物非免疫血清室溫孵育20 min，滴加鼠抗人CD68單克隆抗體或鼠抗人CD31抗體，4 ℃過夜后酶標(biāo)二抗室溫孵育1 h，鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶室溫孵育1 h后DAB法顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，自來水反藍(lán)，乙醇脫水，封片。

1.3.4 微血管密度 （microvessel density，MVD） 和巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)：由CD31染成棕黃色的單個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，可以被認(rèn)為是單獨(dú)的血管。按照WEIDNER［9］報(bào)道的方法，在3個隨機(jī)高倍視野中檢查每個區(qū)域微血管的最大數(shù)量，取其平均值即為MVD，MVD可間接反映CD31的表達(dá)情況。CD68主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，CD68陽性的巨噬細(xì)胞呈棕褐色，在5個隨機(jī)的高倍視野中計(jì)數(shù)，取其平均值作為最終巨噬細(xì)胞數(shù)，可以用巨噬細(xì)胞的數(shù)量反映CD68的表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況和體質(zhì)量變化

對照組小鼠在整個實(shí)驗(yàn)過程中飲食、排便正常。AOM/DSS組與AOM/DSS+EGCG組小鼠在進(jìn)入第1個循環(huán)周期后精神狀態(tài)逐漸萎靡，進(jìn)食較對照組少。進(jìn)入第2個循環(huán)周期后，AOM/DSS+EGCG組小鼠死亡1只，解剖見腸脹氣明顯，應(yīng)為急性腸炎伴梗阻。進(jìn)入第3個循環(huán)周期，AOM/DSS+EGCG組小鼠出現(xiàn)血便。實(shí)驗(yàn)起始時(shí)對照組、AOM/DSS組、AOM/DSS+EGCG組小鼠體質(zhì)量比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P >0.05） 。實(shí)驗(yàn)開始后每周測量小鼠體質(zhì)量，對照組小鼠體質(zhì)量穩(wěn)定增長，AOM/DSS組與AOM/DSS+EGCG組小鼠體質(zhì)量增長較慢，而且AOM/DSS+EGCG組小鼠在飲用DSS后體質(zhì)量下降，停止飲用后體質(zhì)量又再次升高，見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)AOM/DSS組小鼠平均體質(zhì)量較對照組小鼠輕 （P < 0.05） ；AOM/DSS+EGCG組小鼠與對照組小鼠比較平均體質(zhì)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P < 0.01） ，但與AOM/DSS組小鼠比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P > 0.05） 。見表1。

2.2 EGCG促進(jìn)AOM/DSS模型成瘤

圖1 小鼠每周體質(zhì)量變化Fig.1 The body weight of mice was measured every week

對照組小鼠無成瘤或炎癥反應(yīng)；AOM/DSS組10只小鼠中5只出現(xiàn)結(jié)直腸非典型增生，其中4只出現(xiàn)腺瘤，1只出現(xiàn)不典型增生，癌變率為50.00% （5/10） ，與對照組比較癌變率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P < 0.05） ；AOM/DSS+ EGCG組9只小鼠中6只出現(xiàn)結(jié)直腸非典型增生，其中4只出現(xiàn)腺瘤，癌變率為66.67% （6/9） ，與對照組比較癌變率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P < 0.01） ，但與AOM/DSS組比較癌變率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05） 。EGCG雖然沒有明顯增加小鼠結(jié)直腸腺瘤成瘤率，但AOM/DSS+ EGCG組成瘤小鼠腫瘤數(shù)量明顯多于AOM/DSS組 （P < 0.05） 。見表2。

表1 第13周末小鼠體質(zhì)量和腫瘤發(fā)生情況Tab.1 The body weight of mice and the incidence of colorectal cancer at the end of week 13

表2 AOM/DSS組和AOM/DSS+EGCG組小鼠結(jié)直腸腺瘤數(shù)量、CD31標(biāo)記的MDV和CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量比較Tab.2 Comparison of the number of colon adenomas，MVD for CD31，and the number of CD68+ macrophages in the AOM/DSS and AOM/DSS+EGCG groups

2.3 小鼠結(jié)直腸組織病理比較

在第13周末處死小鼠，解剖肉眼可見對照組小鼠結(jié)直腸組織紅潤，無潰瘍出血，無肉芽腫形成；AOM/DSS組與AOM/DSS+EGCG組小鼠結(jié)直腸組織明顯充血水腫，在結(jié)腸遠(yuǎn)端和直腸部位較結(jié)腸近端具有更多的腫瘤負(fù)荷。組織學(xué)上，對照組小鼠腺體結(jié)構(gòu)正常，無黏膜潰瘍；AOM/DSS組小鼠的含瘤結(jié)直腸組織中觀察到隱窩破壞、黏膜表面潰瘍及中性粒細(xì)胞浸潤；AOM/DSS+EGCG組小鼠的含瘤結(jié)直腸組織除了黏膜破壞、中性粒細(xì)胞浸潤外，腺體更加紊亂，瘤細(xì)胞異型性明顯。見圖2。

2.4 CD31和CD68在AOM/DSS組和AOM/DSS+EGCG組小鼠結(jié)直腸腺瘤中的表達(dá)

CD31陽性的腫瘤微血管呈棕黃色，均勻分布于結(jié)直腸腺體之間。AOM/DSS+EGCG組小鼠腫瘤中MDV值明顯高于AOM/DSS組。CD68主要標(biāo)記巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜，AOM/DSS+EGCG組小鼠其生成腫瘤間巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯高于AOM/DSS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P < 0.05） 。見圖3、表2。

3 討論

CRC起源于結(jié)直腸的上皮細(xì)胞，是世界第三高發(fā)腫瘤。在炎性腸病患者中，潰瘍性結(jié)腸炎是結(jié)直腸惡變的一個主要危險(xiǎn)因素，已有研究［10］表明慢性炎癥在結(jié)腸中的促腫瘤作用。潰瘍性結(jié)腸炎到CRC的發(fā)展通過多種機(jī)制演變，主要包括氧化應(yīng)激和轉(zhuǎn)錄激活子3信號通路的活化等［11-12］。 然而，用于預(yù)防炎癥腸疾病導(dǎo)致CRC的有效藥物還未問市。因此，建立炎癥相關(guān)性小鼠CRC模型，對于研究CRC進(jìn)展及藥物研發(fā)極具價(jià)值。用于誘導(dǎo)CRC的AOM/DSS模型［13］基于腹腔注射AOM，然后在飲用水中加入DSS重復(fù)喂養(yǎng)小鼠，其中 DSS誘導(dǎo)結(jié)直腸明顯炎癥，從而促進(jìn)CRC的形成。

圖2 小鼠結(jié)直腸肉眼所見和結(jié)直腸組織病理圖片 HE×100Fig.2 Gross appearance and microscopic findings of the colons in mice HE×100

圖3 CD31和CD68在小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中的表達(dá)情況 CD31×200，CD68×400Fig.3 CD31 and CD68 expression in murine colon adenoma CD31×200，CD68×400

血管生成在CRC的發(fā)展過程中起重要作用，小鼠息肉病模型已經(jīng)表明息肉生長減少與新微血管形成的衰減有關(guān)［14］。典型的抗腫瘤藥物貝伐單抗通過抗體與人血管內(nèi)皮生長因子結(jié)合，阻斷其活性來抑制血管生成，從而達(dá)到抗腫瘤的作用。有研究［15］認(rèn)為可以將CD31同血管內(nèi)皮生長因子一起用于評估腫瘤血管生成，將測出的MVD值作為CRC的一個預(yù)后因素。內(nèi)皮細(xì)胞增生以及異常血管生成在由正常組織向腺瘤轉(zhuǎn)變繼而演發(fā)成惡性過程中起到推波助瀾的作用，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31可以標(biāo)記腫瘤旁微小血管。本研究通過MVD定量評估腫瘤血管生成［16］。MOHAMED等［17］對50例CRC患者的臨床病理學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析，得出CD31高表達(dá)組的患者總體生存率顯著低于CD31低表達(dá)組 （P = 0.023） 。本研究中，AOM/DSS+EGCG組的小鼠結(jié)直腸腫瘤中CD31的表達(dá)明顯高于AOM/DSS組，其與腫瘤生成的數(shù)量有一定相關(guān)性。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展中也起到重要作用，具有高水平巨噬細(xì)胞浸潤腫瘤組織的患者預(yù)后較差［18］。CD68于巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，在正常組織中CD68陽性細(xì)胞主要位于上皮細(xì)胞層之外，而在腫瘤組織中這些細(xì)胞可在上皮腫瘤細(xì)胞之間觀察到［19］。在炎癥的刺激下，不僅細(xì)胞因子和血管成長因子增多，整個機(jī)體的免疫微環(huán)境也在發(fā)生變化。巨噬細(xì)胞在炎癥和癌癥中也具有不可或缺的作用，激活的巨噬細(xì)胞可以產(chǎn)生特定的功能，既能促炎又能抗炎，這些機(jī)制依賴于巨噬細(xì)胞在特定微環(huán)境中獲得的極化表型。有研究［20-21］表明M2型巨噬細(xì)胞在CRC起始的生長和轉(zhuǎn)移中具有關(guān)鍵作用，而且M2型巨噬細(xì)胞還與腫瘤遷移/侵襲相關(guān)因子 （如白細(xì)胞介素-10、腫瘤壞死因子） 的異常增多有關(guān)。M2型巨噬細(xì)胞的典型特征是高度生成趨化因子，包括CCL17、CCL22或CCL24等，使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞聚集，產(chǎn)生大量白細(xì)胞介素-10，導(dǎo)致免疫監(jiān)視功能削弱，甚至促進(jìn)組織重塑和血管生成。CD68作為巨噬細(xì)胞表面分子標(biāo)志物，可通過其表達(dá)檢測腫瘤組織中巨噬細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而研究其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。本研究中，AOM/DSS+EGCG組小鼠的結(jié)直腸腫瘤中CD68的表達(dá)明顯高于AOM/DSS組，其與腫瘤生成的數(shù)量呈正相關(guān)。

HARATIFAR等［4］發(fā)現(xiàn)EGCG能夠抑制HT29結(jié)腸癌細(xì)胞系的增殖，還有研究［9］證實(shí)EGCG能夠通過抑制AKT、ERK1/2通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。然而本研究并沒有證實(shí)這一點(diǎn)，而是發(fā)現(xiàn)EGCG在沒有降低造模小鼠結(jié)直腸腫瘤發(fā)生率的前提下，反而增加腫瘤發(fā)生的數(shù)量。這與GUAN等［6］報(bào)道的結(jié)果相一致，他們的結(jié)果還顯示高劑量的EGCG加重小鼠結(jié)直腸癌變的程度。盡管EGCG在CRC進(jìn)展中的作用機(jī)制和對人類的意義有待進(jìn)一步調(diào)查，但對于服用高劑量綠茶多酚補(bǔ)充劑的人群，尤其是結(jié)腸炎癥患者，可能需要格外注意。

綜上所述，AOM/DSS是構(gòu)建小鼠結(jié)直腸腺瘤模型的一種短期有效方法，口服EGCG增加了AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)直腸非典型增生的發(fā)生率和腫瘤的數(shù)量。除此之外，EGCG可能通過促進(jìn)結(jié)腸中慢性炎癥進(jìn)程和血管生成，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生。