(1.海正藥業(yè)(杭州)有限公司，浙江 杭州 311404；2.浙江奕格資產管理有限公司，浙江 杭州 310051)

沙美特羅氟替卡松吸入劑為白色或類白色的微粉，密封在鋁箔條內的吸入粉霧制劑[1-2]。該鋁箔條纏繞在一模制的塑料裝置中，這種給藥裝置稱為準納器(Diskus)[3]?；颊咄ㄟ^準納器吸嘴將藥物吸至肺部，適應癥為哮喘，該品為非無菌產品[4]。該品通用名為沙美特羅氟替卡松(salmeterol/fluticasone)吸入劑。商品名為舒利迭(Seretide)吸入劑，原研廠家為英國葛蘭素史克(GSK)[5-6]。該品由昔萘酸沙美特羅和丙酸氟替卡松組成[7]。原料藥(API)為昔萘酸沙美特羅和丙酸氟替卡松兩種，昔萘酸沙美特羅化學名為2-(羥甲基)-4-[1-羥基-2-[6-(4-苯基丁氧)己基氨基]乙基]-苯酚，難溶于水，其結構表達式為C25H37NO4；丙酸氟替卡松化學名為6，9-二氟-11-羥-16-甲基-3-氧代-17-(1-氧代丙氧基)-雄甾-1，4-二烯-17-硫代羧酸(6a，11b，16a，17a)-S-(氟甲基)酯，難溶于水，其結構表達式為C25H31F3O5S。沙美特羅結構式中帶3個羧基，在溶液中呈酸性可能對微生物生長有抑制作用[8]。藥品質量控制是藥品生產上市前的最后一道關卡，采取正確的檢測方法呈現(xiàn)產品質量是藥品質量控制實驗室的工作重心，微生物檢測控制是藥品質量控制的一個重要項目[9-11]。根據美國藥典，吸入劑的微生物限度標準為需氧菌總數≤200 cfu/g、霉菌和酵母菌總數≤20 cfu/g，特定微生物(1 g或1 mL)不得檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和耐膽鹽革蘭陰性菌[12]。而根據美國藥典沙美特羅替卡松吸入劑個論，該品微生物限度標準為需氧菌總數≤20 cfu/g、霉菌和酵母菌總數≤20 cuf/g，特定微生物不得檢出大腸埃希菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌[13-14]。因此，該品為微生物控制最嚴格的非無菌產品，加上難溶于水且可能存在抑菌作用，目前尚無相關文獻描述其微生物檢測的方法。筆者通過添加中和劑增強溶解性、薄膜過濾法去除抑菌性等途徑確定了適合該品的微生物限度檢測方法。

1 材料與方法

1.1 樣 品

沙美特羅替卡松吸入劑，海正藥業(yè)(杭州)有限公司吸入藥分公司(批號為18030401)。

1.2 儀器設備

生物安全柜，上海力康公司；滅菌鍋，ALP；電子天平，梅特勒；培養(yǎng)箱，賓得；三聯(lián)過濾器，默克；移液槍，艾本德。

1.3 菌 株

菌株來源為美國典型菌株保藏中心(ATCC)的商業(yè)定量菌株，廠家為Mecconti。包括大腸埃希菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌((SalmonellaparatyphiB)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、枯草芽孢桿菌芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、白色念珠菌(Candidaablicans)和黑曲霉霉(Asperllusniger)等。

1.4 菌懸液

分別取上述各1顆定量菌株小管及溶解液瓶，平衡至室溫25 ℃，將菌株顆粒倒入溶解液瓶，34～38 ℃培養(yǎng)30 min，用漩渦振蕩器混勻，得到<100 cfu/mL的菌懸液，該菌懸液在2～8 ℃可保存8 h[15-16]。

1.5 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基廠家為默克，包括TSA(胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基)，SDA(沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)，TSB(胰酪胨大豆液體培養(yǎng)基)，SDB(沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基)，MCA(麥康凱瓊脂培養(yǎng)基)，MSA(甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基)，CA(溴代十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基)，MCB(麥康凱肉湯培養(yǎng)基)，RVSEB(氯化鎂孔雀綠增菌培養(yǎng)基)，XLDA(木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基)和pH為7.0的氯化鈉蛋白胨緩沖液等。

1.6 微生物限度檢查法計數法檢測方法

采用美國藥典第61～62章節(jié)的方法進行研究，計數法需要進行回收率計算，特定微生物需要觀察菌落特征。若在產品放行檢測中發(fā)現(xiàn)特定微生物，則需要采取進一步進行菌株鑒定[17-18]。

1.6.1 常規(guī)法

取裝置數個，拆開裝置撕開鋁箔條取出粉末供試品，稱重5 g，加入100 mL緩沖液中，充分混勻溶解，制備試驗組、菌液組、供試品對照組和稀釋級對照組。

試驗組：取1 mL注入空平皿中，加入<100 cfu菌懸液。

菌液組：分別取制備好的菌懸液1 mL放于不同的空平皿中。

供試品對照組：操作方法同試驗組但不加入試驗菌。

稀釋劑對照組：取1 mL緩沖液放于空平皿中。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌加入融化的且不超過45 ℃的TSA，待凝固后32.5 ℃培養(yǎng)3 d；白色念珠菌和黑曲霉加入融化的不超過45 ℃的SDA，待凝固后22.5 ℃培養(yǎng)5 d。進行3次獨立的平行試驗，分別計算各個菌的回收率。

1.6.2 薄膜過濾法

取裝置數個，拆開裝置撕開鋁箔條取出粉末供試品，稱重5 g，加入100 mL緩沖液，充分混勻溶解，為供試液。制備試驗組、菌液組、供試品對照組和稀釋劑對照組。

試驗組：取10 mL供試液至濾杯中，注入50 mL緩沖液中，薄膜過濾，沖洗液100 mL/膜，在最后一次沖洗液中加入試驗菌，并過濾。

菌液組：分別取制備好的菌液1 mL到濾杯中，加入50 mL緩沖液，過濾。

供試品對照組：操作方法同試驗組但不加入試驗菌。

稀釋劑對照組：取緩沖液1 mL到濾杯中，加入50 mL緩沖液，以下操作同試驗組。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌取下膜貼于TSA平板中，32.5 ℃培養(yǎng)3 d。白色念珠菌和黑曲霉取下膜貼于SDA平板中，22.5 ℃培養(yǎng)5 d。進行3次獨立的平行試驗，分別計算各個菌的回收率。

1.6.3 薄膜過濾法加中和劑

取裝置數個，拆開裝置撕開鋁箔條取出粉末供試品，稱重5 g，稱重0.1 g中和劑吐溫80，加入100 mL緩沖液混勻溶解，制成供試液。制備試驗組、菌液組、供試品對照組和稀釋劑對照組。

試驗組：取10 mL供試液至濾杯中，加入50 mL緩沖液，薄膜過濾，沖洗液為100 mL/次，沖洗1次，在最后一次沖洗液中加入試驗菌，并過濾。

菌液組：分別取制備好的菌液1 mL到濾杯中，加入50 mL緩沖液，過濾。

供試品對照組：操作方法同試驗組但不加入試驗菌。

稀釋劑對照組：取緩沖液1 mL到濾杯中，加入50 mL緩沖液，以下操作同試驗組。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌取下膜貼于TSA平板中，32.5 ℃培養(yǎng)3 d；白色念珠菌和黑曲霉取下膜貼于SDA平板中，22.5 ℃培養(yǎng)5 d。進行3次獨立的平行試驗，分別計算各個菌的回收率。

1.7 微生物限度檢查法特定微生物檢測方法

1.7.1 大腸埃希菌

稱取4 g樣品，加入10 mL緩沖液，再加入0.08 g中和劑吐溫80，振蕩2 min，最后加入70 mL緩沖液，振蕩1 min，靜置10 min。取上述供試液20 mL，接種到100 mL TSB中，混合，再向制備的試驗組中加入<100 cfu的大腸埃希菌菌懸液，30～35 ℃培養(yǎng)18 h。從試驗組培養(yǎng)后的TSB中，移取1 mL培養(yǎng)物加到100 mL麥康凱肉湯中，42～44 ℃培養(yǎng)24 h。然后使用接種環(huán)從麥康凱肉湯的培養(yǎng)物中，挑取少許培養(yǎng)物在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線接種，制備1個平皿，30～35 ℃培養(yǎng)18 h。取20 mL緩沖液代替供試液進行試驗，作為陰性對照組。

如果在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上發(fā)現(xiàn)紅色塊狀物及可能環(huán)繞著膽汁沉淀環(huán)的菌落特征，則試驗組中檢出大腸埃希菌，在本實驗室條件下該方法適用。同時陰性對照結果應不得檢出。

1.7.2 沙門氏菌

稱取4 g樣品，加入10 mL緩沖液，再加入0.08 g中和劑吐溫80，振蕩2 min，最后加入70 mL緩沖液，振蕩1 min，靜置10 min。取上述供試液20 mL，接種到100 mL TSB，混勻，再向制備的試驗組中加入<100 cfu的沙門氏菌菌懸液，30～35 ℃培養(yǎng)18 h。移取0.1 mL TSB轉移到10 mL的氯化鎂孔雀綠沙門氏菌增菌肉湯上，30～35 ℃培養(yǎng)18 h。使用接種環(huán)從氯化鎂孔雀綠沙門氏菌增菌肉湯的培養(yǎng)物中，挑取少許培養(yǎng)物在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板劃線接種，制備1個平皿，于30～35 ℃培養(yǎng)18 h。取20 mL緩沖液代替供試液進行試驗，作為陰性對照組。

如果在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板上發(fā)現(xiàn)帶或不帶黑心的發(fā)育良好的紅色的菌落特征，則試驗組中檢出沙門氏菌，在本實驗室條件下該方法適用。同時陰性對照結果應不得檢出。

1.7.3 金黃色葡萄球菌

稱取4 g樣品，加入10 mL緩沖液，再加入0.08 g中和劑吐溫80，振蕩2 min，最后加入70 mL緩沖液，振蕩1 min，靜置10 min。取上述供試液20 mL，接種到100 mL TSB，混勻，再向制備的試驗組中加入<100 cfu的金黃色葡萄球菌菌懸液，30～35 ℃培養(yǎng)18 h。然后使用接種環(huán)從TSB培養(yǎng)物中，挑取少許培養(yǎng)物在甘露醇氯化鈉瓊脂平板劃線接種，制備1個平皿，30～35 ℃培養(yǎng)18 h。取20 mL緩沖液代替供試液進行試驗，作為陰性對照組。

如果在甘露醇氯化鈉瓊脂平板上發(fā)現(xiàn)黃色區(qū)帶環(huán)繞的黃色或白色的菌落特征，則試驗組中檢出金黃色葡萄球菌，在本實驗室條件下該方法適用。同時陰性對照結果應不得檢出。

1.7.4 銅綠假單胞菌

稱取4 g樣品，加入10 mL緩沖液，再加入0.08 g中和劑吐溫80，振蕩2 min，最后加入70 mL緩沖液中，振蕩1 min，靜置10 min。取上述供試液20 mL，接種到100 mL TSB，混合，再向制備的試驗組中加入<100 cfu的銅綠假單胞菌菌懸液。30～35 ℃培養(yǎng)18 h。然后使用接種環(huán)從TSB培養(yǎng)物中，挑取少許培養(yǎng)物在溴代十六烷基三甲銨瓊脂平板劃線接種，制備1個平皿，30～35 ℃培養(yǎng)18 h。取20 mL緩沖液代替供試液進行試驗，作為陰性對照組。

如果在溴代十六烷基三甲銨瓊脂平板上發(fā)現(xiàn)綠色熒光環(huán)圍繞的菌落特征，則試驗組中檢出銅綠假單胞菌，在本實驗室條件下該方法適用。同時陰性對照結果應不得檢出。

2 結果與分析

2.1 微生物限度檢查法計數法結果與分析

2.1.1 結 果

微生物限度檢查法中的計數法實驗為定量實驗，回收率的實驗結果可能由于樣品存在不溶性、抑菌性等而不符合標準。常規(guī)法、薄膜過濾法和薄膜過濾法加中和劑的各個菌回收率結果如表1所示。

注：1) 組1為試驗組；組2為稀釋劑對照組。

2.1.2 分 析

常規(guī)法3次試驗結果表明，白色念珠菌和黑曲霉的試驗組和稀釋劑對照組的回收率均低于50%，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的試驗組和稀釋劑對照組回收率均高于50%。由于樣品的抑菌性，對計數結果產生影響，故霉菌和酵母菌計數不可用常規(guī)法進行檢查。

薄膜過濾法3次試驗結果表明，平板上有很厚的樣品鋪在薄膜上且白色念珠菌和黑曲霉的試驗組和稀釋劑對照組的回收率均低于50%，而金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌試驗組和稀釋劑對照組的回收率均高于50%。由于樣品溶解性低，對計數結果產生影響，故霉菌和酵母菌計數不可用薄膜過濾法進行檢查。

薄膜過濾法加中和劑3次平行試驗結果表明，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉試驗組和稀釋劑對照組的回收率均高于50%。說明加入中和劑能增加溶解性且通過薄膜過濾法能去除了抑菌性，可以采用薄膜過濾法加中和劑進行微生物限度檢查法計數法檢查。

通過上述3組試驗，確定了通過薄膜過濾法加中和劑進行5種菌株的回收率測試，回收率結果符合要求。故沙美特羅替卡松吸入劑可采用薄膜過濾法加中和劑進行方法確認及相應產品的放行測試。

2.2 微生物限度檢查法特定微生物結果與分析

2.2.1 結 果

微生物限度檢查法中的特定微生物檢查實驗為定性實驗。通過增菌培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)和特定瓊脂培養(yǎng)等步驟確定樣品中不得含有某種微生物。因此，通過計數法結果得知，雖然某幾個微生物生長會受抑制，但是結果是有微生物生長。因此采用常規(guī)的方法進行特定微生物檢查實驗，所有特定微生物培養(yǎng)結果如表2所示。

注：1) “+”為陽性；“-”為陰性。

2.2.2 分 析

由上述試驗結果可知，大腸埃希菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌等4個特定微生物檢查結果試驗組都呈陽性，陰性對照都呈陰性。故該4個特定微生物檢測可采用相應的方法進行方法確認及相應產品的放行測試。

3 結 論

實驗結果表明，沙美特羅替卡松吸入劑溶解性低，且有較強的抑菌作用。采用常規(guī)方法、薄膜過濾法進行微生物限度檢查法確認，白色念珠菌和黑曲霉兩株陽性菌株的試驗組和稀釋級對照組的回收率均未達到50%。經過研究，確定沙美特羅替卡松吸入劑微生物限度檢查法采用薄膜過濾法加中和劑增強溶解性、去除抑菌作用，然后進行計數法檢查。特定微生物大腸埃希菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌采用相應的方法進行微生物限度檢查法特定微生物檢查。