高天翔，王露萍，遲長鳳，江麗華，王世鋒

（1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022；3.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022；4.海南大學(xué)海洋學(xué)院，海南?？?570228）

曼氏無針烏賊(Sepiella maindroni de Rochebrune)俗稱烏賊、墨魚、血墨。分布于渤海、黃海、東海、南海，為印度洋和西太平洋廣分布種，其中心分布區(qū)在中國浙江近海和閩東海域。曼氏無針烏賊是東海重要經(jīng)濟種類，20 世紀(jì)50-70 年代曾是舟山漁場“四大海產(chǎn)”之一，但由于資源的不合理利用，以及生態(tài)環(huán)境的破壞，80 年代中后期，浙江沿海漁場曼氏無針烏賊產(chǎn)量急劇下降，已形不成漁汛，瀕臨滅絕[1]。21 世紀(jì)初，浙江海洋學(xué)院和寧波大學(xué)先后開展了曼氏無針烏賊人工繁育技術(shù)研究，并取得突破。2007-2009 年浙江海洋學(xué)院研究團隊在浙江沿海的舟山東極海域、臺州大陳海域、溫州洞頭海域開展小規(guī)模曼氏無針烏賊苗種（受精卵）探索性增殖放流研究[2]。近年來，福建省和江蘇省也相繼開展了曼氏無針烏賊的增殖放流工作。隨著人工繁育技術(shù)的突破和人工增殖放流工作的開展，目前資源量得到了顯著恢復(fù)，據(jù)相關(guān)報道資源量已恢復(fù)至2 000 t 的水平[3]。目前有關(guān)曼氏無針烏賊的研究工作主要集中在繁殖生物學(xué)[4-6]、增殖放流[1,7]及營養(yǎng)飼料[8-10]等方面。

染色體是生物發(fā)育、進化、遺傳和變異的物質(zhì)基礎(chǔ)，研究染色體的行為、數(shù)目、核型和帶型等對于了解生物的遺傳組成、遺傳變異規(guī)律、發(fā)育機制、物種起源和親緣關(guān)系、進化地位、分類及種族關(guān)系等都具有重要的參考價值[11]。目前有關(guān)頭足類染色體的研究國內(nèi)外已開展較多研究：萊氏擬烏賊Sepioteuthis lessoniana[12]、長蛸Octopus minor[13]、金烏賊Sepia esculenta[14]、鸚鵡螺Nautilus macromphalus[15]等。但有關(guān)曼氏無針烏賊染色體核型分析的研究在國內(nèi)外尚未見報道。本研究制備了曼氏無針烏賊染色體并進行了核型分析，以期為曼氏無針烏賊的遺傳背景和資源保護提供種質(zhì)特征方面的相關(guān)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

曼氏無針烏賊親體為舟山漁場的野生烏賊，選擇體質(zhì)健康、性成熟個體，在室內(nèi)人工養(yǎng)殖，實驗樣品取自親體產(chǎn)出的受精卵和不同發(fā)育階段的胚胎。

1.2 實驗方法

1.2.1 染色體標(biāo)本的制備

參照王曉華等[14]的金烏賊染色體制備方法，并對其方法進行優(yōu)化。選取紅眼期曼氏無針烏賊胚胎，剝?nèi)ヂ涯?，取出胚胎。將胚胎浸?.04%的秋水仙素溶液，浸泡處理1 h，去凈秋水仙素，用0.075 mol·L-1KCl低滲處理45 min，離心，移去低滲液，加入4℃預(yù)冷的卡諾氏國定液（甲醇：冰醋酸=3:1）固定，間隔15 min換固定液1 次，連續(xù)固定3 次，然后加入50%冰醋酸進行解離，解離時間為45 min。將解離好的樣品熱滴法滴片，空氣干燥過夜。

1.2.2 染色體數(shù)目統(tǒng)計及核型分析

制備好的染色體玻片用10% Giemsa 染液染色20 min，蒸餾水沖洗，自然晾干后進行顯微觀察和拍照。選擇分散良好、形態(tài)清晰、兩條臂適當(dāng)分開且數(shù)目完整的中期分裂相約40 個進行拍照。進行染色體計數(shù)、測量，并根據(jù)LEVAN A,et al[16]的分類標(biāo)準(zhǔn)進行染色體配對、分組，制作核型圖。

2 結(jié)果

2.1 染色體數(shù)目

實驗對40 個分散良好的中期分裂相進行染色體計數(shù)，曼氏無針烏賊二倍體染色體數(shù)為92 的約占所統(tǒng)計中期分裂相的91%，占絕對優(yōu)勢，由此可以判定曼氏無針烏賊的二倍體染色體數(shù)目為2n=92。

2.2 染色體核型

選取3 個分散良好，形態(tài)清晰的中期分裂相進行測量和統(tǒng)計分析，獲得曼氏無針烏賊染色體的相對長度[染色體相對長度=（單條染色體長度×2/全部染色體總長度）×100]、臂比及其核型，如圖1 和表1 所示。根據(jù)LEVAN，et al[16]提出的核型分類標(biāo)準(zhǔn)，可將曼氏無針烏賊染色體分為4 個類型，其中，m 型染色體28 對，sm 型12 對，st 型4 對，t 型3對，核型公式為2n=54m+24sm+8st+6t，臂數(shù)（NF）=170。

圖1 曼氏無針烏賊染色體中期分裂相（A）及核型（B）Fig.1 Metaphase chromosomes (A) and karyotype (B) of S.maindroni

表1 曼氏無針烏賊染色體相對長度及臂比值(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab.1 Relative length and ratio of chromosomes in S.maindroni

3 討論

3.1 染色體的制備

提取到新陳代謝旺盛、分裂增生較快的組織是成功制備染色體的基本條件[17-18]。魚類染色體的獲得通常采用體內(nèi)注射PHA 腎細(xì)胞培養(yǎng)法[18]，但是由于頭足類染色體數(shù)目多及形態(tài)大小適中的染色體中期分裂相較難獲得等原因。據(jù)報道，用于頭足類染色體的制備組織有3 種：（1）雄性的精細(xì)胞[19-20]；（2）鰓心血液[17]；（3）胚胎[12-13,21]。采用胚胎制作頭足類染色體可以獲得比較理想的結(jié)果[12]。本研究在制備曼氏無針烏賊染色體的過程中，分別選取了受精卵和不同發(fā)育時期的胚胎作為染色體制備材料。實驗發(fā)現(xiàn)只有以紅眼期的曼氏無針烏賊胚胎為材料制備的染色體中，染色體分散最好，中期分裂相對較多，且染色體的形態(tài)最為清晰。因此，本研究認(rèn)為曼氏無針烏賊染色體標(biāo)本的制備材料以紅眼期胚胎最佳。

3.2 染色體核型與種質(zhì)鑒定關(guān)系

染色體是遺傳物質(zhì)的主要載體，染色體核型研究是細(xì)胞遺傳學(xué)的基礎(chǔ)，染色體組型在很大程度上具有物種的特異性，特定的生物體具有特定數(shù)目、形態(tài)特征的染色體[22-23]。染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)對于研究物種進化具有重要作用。目前國內(nèi)外頭足類染色體核型研究僅13 例（表2）。GAO Yuemian,et al[12]成功對5 種頭足類染色體核型進行了描述，這5 種頭足類染色體數(shù)目均為92 條，核型稍有差別。而在此之前的很多研究，由于未獲得好的中期分裂相或者顯微拍照質(zhì)量等原因，僅進行了染色體數(shù)目描述。WANG Jinhai,et al[13]對3 種蛸類做了染色體核型分析，發(fā)現(xiàn)基于染色體核型進化距離和核型近似系數(shù)的頭足類進化分析，與基于線粒體全序列的頭足類進化樹結(jié)果一致，可以作為傳統(tǒng)分類學(xué)和分子系統(tǒng)分析的補充，有望成為常規(guī)系統(tǒng)發(fā)育的輔助手段。然而在魚類研究中，由于魚類核型基本都是端部著絲粒染色體，核型進化距離和近似系數(shù)法并不適用。已有的頭足類染色體研究結(jié)果與基于線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I 的建樹結(jié)果相一致（圖3），其中鸚鵡螺染色體數(shù)目為52 條，是頭足類最為古老的物種，而八腕總目染色體數(shù)目均為60 條，十腕總目染色體數(shù)除阿拉伯烏賊染色體數(shù)目為68 條外，其余均為92 條。十腕總目染色體數(shù)目具有高度一致性，但是不同種類的核型不同，可作為鑒別不同種屬的重要依據(jù)。目前，頭足類分類最傳統(tǒng)的方法是依據(jù)其形態(tài)特征，通過對個體的分節(jié)特征、度量特征和解剖學(xué)特征的測量和鑒定，依據(jù)這些特征的差異進行分類[24]。但是頭足類在受外界刺激或死亡狀態(tài)下體色容易改變；另外，大多數(shù)頭足類的幼體階段外部特征比較相似。這些問題都為僅僅依靠形態(tài)學(xué)的方法鑒別頭足類種類帶來困難。因此，在頭足類種類鑒別過程中，無法通過形態(tài)特征進行區(qū)分時，可以考慮使用染色體核型的方法。染色體核型的多樣化為頭足類的系統(tǒng)分類和種質(zhì)鑒定有著重要的輔助作用。

圖3 基于線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I（COI）的頭足類進化樹Fig.3 Phylogenetic relationships among the cephalopods based on mitochondrial COI gene sequence

表2 部分已報道頭足類染色體核型Tab.2 Karyotypes of several reported species of the cephalopods

為了更好研究頭足類染色體遺傳信息，在今后研究中應(yīng)采用除染色體核型以外，開展帶型研究、染色體核仁組織區(qū)及熒光原位雜交技術(shù)的綜合分析。