梁 佳 ，章俊濤，趙鮮鮮，橘勝康，谷山茂人，宮崎里帆，謝 超

(1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021；3.長(zhǎng)崎大學(xué)大學(xué)院水產(chǎn)、環(huán)境科學(xué)綜合研究科，日本長(zhǎng)崎 8 528521)

眾所周知，魚類的肌肉與哺乳動(dòng)物完全不同，是由血合肉(紅肉)和普通肉(白肉)兩種肌肉類型構(gòu)成。而在食品加工領(lǐng)域，普通肉一直以來都是以一種肌肉類型來作為研究對(duì)象。實(shí)際上魚類體側(cè)肌被分類為三部分：由表皮到中心依次為血合肉部，中間肉部以及普通肉部。血合肉被命名為紅色肉(red muscle)(TypeⅠ)，中間肉為只有魚類才存在的粉色肌肉(pink muscle)，普通肉是由白色肌肉的Ⅱa 型(TypeⅡa)和Ⅱb 型(TypeⅡb)組成[1-3]。這些肌肉類型的分類是根據(jù)肌肉顏色、酶特性、肌肉結(jié)構(gòu)組織學(xué)及其代謝特性來進(jìn)行分類的[4-6]。JABARSYSH，et al[7]的研究表明大部分魚類的普通肉部分并不是單純的由白色肌肉(TypeⅡ)構(gòu)成的，其中都有粉色肌肉細(xì)胞呈馬賽克樣式的混合存在。再者，以往研究表明不同魚類中粉色肌肉細(xì)胞在普通肉中的存在方式及所占的肌肉細(xì)胞數(shù)量和分布情況各不相同[4，5，8]。

YADA，et al[8]研究表明粉色肌肉細(xì)胞在普通肉中存在的比例直接影響鮮度變化。存在比例越高，其鮮度指標(biāo)K 值越大。此外，魚體死后僵直也受粉色肌肉存在比例及存在方式影響[7-8]。然而，目前基本上沒有相關(guān)研究表明粉色肌肉的存在情況與肌肉硬度(彈性)的關(guān)系性，即在流行海鮮生食的今天，粉色肌肉細(xì)胞的分散存在是否會(huì)影響肌肉的品質(zhì)(質(zhì)構(gòu))尚不清楚。研究者在過去的研究中對(duì)養(yǎng)殖鯉魚冰藏條件下不同肌肉類型的特性進(jìn)行研究[9]，本研究將繼續(xù)利用養(yǎng)殖鯉魚為研究對(duì)象，探索粉色肌肉細(xì)胞的存在對(duì)肌肉質(zhì)構(gòu)(質(zhì)構(gòu))的影響。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

1.1.1 原料

鮮活養(yǎng)殖鯉魚6 尾(舟山市水產(chǎn)市場(chǎng)購買)，平均體質(zhì)量為8.68±1.15 kg，平均體長(zhǎng)為33.5±2.7 cm，購買后運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，室溫下暫養(yǎng)24 h 后立即處理。將活鯉魚去頭、去內(nèi)臟，脊髓破壞速殺處理，裝入聚氯乙烯袋中冰藏保存。

1.1.2 儀器

奧林巴斯BX50 光學(xué)顯微鏡;質(zhì)構(gòu)儀RE-3305s。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 組織學(xué)切片

取處理后的鯉魚，從背部沿體側(cè)肌表皮切下1 cm 左右厚度的2 塊肌肉組織樣品，肉眼辨別粉色肌肉、粉色肌肉與白色肌肉交界層，并在粉色肌肉及粉色肌肉與白色肌肉連接處進(jìn)行取樣，過碘酸雪夫(PAS)和腺苷三磷酸酶(ATPase)染色切片使用[10]。ATPase 染色參照GOLLNICK，et al[11]和GUTH，et al[12]的改良方法制成冷凍切片、PAS 染色將組織樣品制成石蠟切片用顯微鏡觀察進(jìn)行肌肉細(xì)胞類型的識(shí)別。

1.2.2 利用光學(xué)顯微鏡染色切片計(jì)算粉色肌肉細(xì)胞存在于普通肉中的比率

利用數(shù)碼相機(jī)將PAS 染色的肌肉橫截面切片在光學(xué)顯微鏡下拍攝后，利用Adobe Photoshop 軟件對(duì)放大的PAS 染色照片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，利用NIH Image[13]圖像分析軟件分析普通肉中存在的粉色肌肉細(xì)胞數(shù)量比率和粉色肌肉細(xì)胞面積比率。每一樣品從鄰近粉色肌肉層開始于普通肉層，由魚骨脊髓中心至表皮依次取a、b、c 3 點(diǎn)統(tǒng)計(jì)。最終求得的比率為3 處不同染色切片的平均值。PAS 染色所使用的樣品即為破斷強(qiáng)度測(cè)定部位的樣品。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)最終形式為平均值(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，線性回歸的參數(shù)(斜率，指函數(shù)圖形與坐標(biāo)交點(diǎn)到原點(diǎn)的距和相關(guān)系數(shù)r)利用X、Y 兩變量的最小二乘法計(jì)算。相關(guān)系數(shù)的顯著水平利用r 值表求得。

1.2.4 肌肉質(zhì)構(gòu)的測(cè)定

為測(cè)定鯉魚死后肌肉彈性(破斷強(qiáng)度)，冰藏2 d 后樣本魚沿體側(cè)線從背部肉取樣。取樣時(shí)垂直于肌肉細(xì)胞排列方向、避開筋膜較多部分切下厚度為10 mm 的樣品。每一樣品通過肉眼識(shí)別，避開粉色肌肉層后由魚骨脊髓中心至表皮依次取a、b、c 3 點(diǎn)測(cè)量。測(cè)定時(shí)垂直于肌肉橫截面直徑2 mm 的圓柱形探頭插入樣品中，插入樣品瞬間的最大值為破斷強(qiáng)度(N·cm-2)。速度為1 mm·s-1測(cè)定5 次，去除最大最小值，取平均值[9]。

2 結(jié)果分析

2.1 粉色肌肉細(xì)胞光學(xué)顯微鏡識(shí)別

2.1.1 ATPase 染色觀察

ATPase 染色主要是通過肌球蛋白在酸堿條件下的穩(wěn)定性的不同來辨別其肌肉類型。圖1a 為酸處理過的鯉魚背部肌肉組織的冷凍切片，圖1b 為堿處理過的鯉魚背部肌肉組織的冷凍切片。從圖1 可以看出，在同一部位取樣的魚肉切片分別在酸性及堿性條件下處理后，在酸性條件下，粉色肌肉細(xì)胞被染成深色，白色肌肉細(xì)胞被染成淡灰色，在堿性條件下，粉色肌肉細(xì)胞仍然被染成黑色，而白色肌肉細(xì)胞無色。由此說明，粉色肌肉細(xì)胞無論在酸性或堿性條件下處理仍然保持活性，而白色肌肉細(xì)胞在堿性條件下無活性。由此可以辨別粉色肌肉細(xì)胞在白色肌肉中的分散存在。

圖1 鯉魚背部肌肉ATPase 染色圖Fig.1 Photograph of the cross section of dorsal ordinary muscle in carp stained by ATPase method

2.1.2 PAS 染色觀察

對(duì)于魚類肌肉結(jié)構(gòu)來說，沿體側(cè)線表皮到中心依次為紅色肌肉層，靠近紅色肌肉附近存在較薄的粉色肌肉層(有些魚類不存在粉色肌肉)、粉色肌肉分散在白色肌肉中的層、白色肌肉層[1]。本次染色的取樣部分為通過肉眼觀察后的粉色肌肉層以及粉色肌肉與白色肌肉交界處部分。從圖2 可以看出，左側(cè)粉色肌肉中糖原含量多的1/3 部分被染成均勻淡灰色，右側(cè)2/3 部分可以觀察到，被染成淡灰色肌肉細(xì)胞分散在幾乎沒有被染色的糖原含量較少的白色肌肉細(xì)胞中。由此可見，鯉魚肌肉中存在較薄的粉色肌肉層，并且其粉色肌肉細(xì)胞均勻分散在背部肌肉中心的白色肌肉中。

圖2 鯉魚背部肌肉PAS 染色圖Fig.2 Photograph of the cross section of dorsal ordinary muscle in carp stained by PAS method

2.2 粉色肌肉細(xì)胞分散在普通肉中的細(xì)胞數(shù)量比率

養(yǎng)殖鯉魚背部肌肉中粉色肌肉細(xì)胞分散在普通肉中的細(xì)胞數(shù)量比例統(tǒng)計(jì)如表1 所示。粉色肌肉細(xì)胞存在的數(shù)量比例在同一樣品魚不同位置的比率有所不同，為43.7%～68.4%。距離脊椎最近的a 位置粉色肌肉細(xì)胞所占比例為50.0%～68.4%，平均值為56.9%；測(cè)定位置b 所占比例為43.7%～64.4%，平均值為53.3%；離表皮最近的c 位置測(cè)定的粉色肌肉細(xì)胞數(shù)量比例為50.8%～66.5%，平均值為58.8%。

2.3 粉色肌肉細(xì)胞分散在普通肉中的細(xì)胞面積比率

養(yǎng)殖鯉魚背部肌肉中粉色肌肉細(xì)胞分散在普通肉中的細(xì)胞面積比例統(tǒng)計(jì)如表2 所示。粉色肌肉細(xì)胞在普通肉中分散存在的面積比率為12.7%～34.7%，距脊髓最近的a 位置為12.7%～29.0%，平均值為18.1%；b 位置為13.2%～34.7%，平均值為18.6%；距表皮最近的c 位置為18.5%～30.6%，平均值為22.9%；由此可見，由中心至表皮，粉色肌肉細(xì)胞存在的面積比率逐漸增高。

表1 鯉魚粉色肌肉細(xì)胞分散存在于背部普通肉中的細(xì)胞數(shù)量比率Tab.1 Interposition number percentages of pink muscle fibers in dorsal ordinary muscle in carp

表2 鯉魚粉色肌肉細(xì)胞分散存在于背部普通肉中的細(xì)胞面積比率Tab.2 Interposition area percentages of pink muscle fibers in dorsal ordinary muscle in carp

2.4 破斷強(qiáng)度

鯉魚冰藏第2 天的破斷強(qiáng)度結(jié)果如表3 所示。即便是同一樣品魚，因測(cè)定部位不同破斷強(qiáng)度水平各有不同。距脊髓最近的a 位置破斷強(qiáng)度為11.2～19.5 N·cm-2，平均值為15.7 N·cm-2；b 位置為11.0～32.6 N·cm-2，平均值為19.7 N·cm-2；距表皮最近的c 位置為18.1～29.4 N·cm-2，平均值為23.2 N·cm-2；由此可見，由中心至表皮，粉色肌肉的破斷強(qiáng)度即質(zhì)構(gòu)變化逐漸增高。

表3 鯉魚粉色肌肉細(xì)胞分散存在于背部普通肉中的破斷強(qiáng)度Tab.3 Breaking force in dorsal ordinary muscle of carp storage in ice

2.5 鯉魚普通肉中粉色肌肉細(xì)胞的分散存在與破斷強(qiáng)度的關(guān)系

2.5.1 粉色肌肉細(xì)胞存在的數(shù)量比例與破斷強(qiáng)度的關(guān)系

鯉魚普通肉中a、b、c 各位置粉色肌肉細(xì)胞存在的數(shù)率與其位置的破斷強(qiáng)度關(guān)系如圖3 所示。雖然粉色肌肉細(xì)胞存在的數(shù)率與其位置的破斷強(qiáng)度兩者相關(guān)性不顯著，但仍可以看出兩者存在正向相關(guān)(r=+0.101，n=17)。

2.5.2 粉色肌肉細(xì)胞存在的面積比例與破斷強(qiáng)度的關(guān)系

鯉魚普通肉中a、b、c 各位置粉色肌肉細(xì)胞存在的面積比例與其位置的破斷強(qiáng)度關(guān)系如圖4 所示。由結(jié)果可看出，粉色肌肉細(xì)胞的面積在普通肉中分散存在的比例越大，破斷強(qiáng)度值越大，即肌肉質(zhì)構(gòu)強(qiáng)度越強(qiáng)，兩者存在顯著的正向相關(guān)性(r=+0.540，n=17，p＜0.05)。

3 結(jié)論

圖3 鯉魚粉色肌肉細(xì)胞存在的數(shù)量比例與破斷強(qiáng)度的關(guān)系Fig.3 Relationship between number percentage of pink muscle fibers and breaking force in dorsal ordinary muscle of carp

圖4 鯉魚粉色肌肉細(xì)胞存在的面積比例與破斷強(qiáng)度的關(guān)系Fig.4 Relationship between area percentage of pink muscle fibers and breaking force in dorsal ordinary muscle of carp

本研究通過對(duì)養(yǎng)殖鯉魚背部普通肉中粉色肌肉細(xì)胞的分散存在情況通過ATPase 及PAS 染色進(jìn)行辨別，并通過PAS 染色后的石蠟切片在顯微鏡下的拍攝，統(tǒng)計(jì)分析出粉色肌肉細(xì)胞在普通肉中的存在情況，結(jié)合統(tǒng)計(jì)的相同位置肌肉的破斷強(qiáng)度值進(jìn)行分析?？梢钥闯觯凵∪饧?xì)胞在鯉魚背部肌肉中由中心至表皮分散存在的比例(數(shù)量及面積)逐漸增加，即鯉魚背部肌肉中由中心至表皮肌肉質(zhì)構(gòu)呈逐漸增加趨勢(shì)；鯉魚粉色肌肉細(xì)胞在普通肉中的分散存在(數(shù)量及面積)的比例與破斷強(qiáng)度均呈正相關(guān)，其中粉色肌肉細(xì)胞在普通肉中分散存在的面積比例與其破斷強(qiáng)度呈顯著相關(guān)性(r=+0.540，n=17，p＜0.05)，由此，鯉魚粉色肌肉細(xì)胞在其背部普通肉中分散存在的比例會(huì)影響肌肉的硬度彈性。因不同魚類的生活環(huán)境、代謝特征及飼養(yǎng)情況均可以影響到其粉色肌肉細(xì)胞的分布情況[14]，海產(chǎn)魚或其他淡水魚類中是否有相同趨勢(shì)，有待于進(jìn)一步研究。