李燕玲，陳 柯

1暨南大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510000；2南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院，廣東 廣州 510000

牙的發(fā)育是連續(xù)而復(fù)雜的生理過(guò)程，是牙源性上皮與間充質(zhì)相互作用的結(jié)果，包括帽狀期、蕾狀期、鐘狀期、牙根的發(fā)育和牙齒的萌出[1]。牙根的發(fā)育始于牙冠發(fā)育完成后，由精細(xì)而復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控完成。牙源性干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為牙組織工程帶來(lái)了許多未知的可能，其中牙源性干細(xì)胞與牙根發(fā)育機(jī)制的聯(lián)系至關(guān)重要，研究牙根發(fā)育的機(jī)制可為牙組織工程指明方向。本文從牙根發(fā)育的過(guò)程、影響牙根發(fā)育的相關(guān)因子及牙源性干細(xì)胞與牙根發(fā)育機(jī)制的聯(lián)系三個(gè)方面對(duì)牙根發(fā)育機(jī)制的進(jìn)展進(jìn)行闡述。

1 牙根發(fā)育的過(guò)程

牙根發(fā)育由上皮和間充質(zhì)細(xì)胞的相互作用指導(dǎo)完成，牙冠發(fā)育即將完成時(shí)，牙釉質(zhì)的發(fā)育轉(zhuǎn)變?yōu)檠拦琴|(zhì)的發(fā)育，此時(shí)形成釉牙骨質(zhì)界的分界線。成釉器的內(nèi)釉上皮和外釉上皮在頸環(huán)處增生，向未來(lái)的根尖孔方向生長(zhǎng)，這種雙層細(xì)胞的結(jié)構(gòu)稱為上皮根鞘（HERS）。上皮根鞘由兩層上皮細(xì)胞組成，包括內(nèi)釉上皮和外釉上皮，而成釉器的另外兩個(gè)結(jié)構(gòu)——中間層和星網(wǎng)狀層消失，這可以認(rèn)為是牙冠發(fā)育向牙根發(fā)育過(guò)渡的轉(zhuǎn)變[1]。上皮根鞘分泌多種因子，可誘導(dǎo)牙乳頭細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，若其連續(xù)性遭到破壞，則會(huì)引起牙根發(fā)育異常。第一層牙本質(zhì)形成之際，上皮細(xì)胞與牙本質(zhì)表面分離，斷裂形成網(wǎng)狀，牙囊細(xì)胞穿過(guò)上皮根鞘再移向根部牙本質(zhì)，分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞，分泌牙骨質(zhì)基質(zhì)。此外，部分浸潤(rùn)的牙囊細(xì)胞在牙本質(zhì)或周圍的上皮根鞘細(xì)胞的誘導(dǎo)下，分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞，在牙根表面和牙周膜纖維的周圍分泌有機(jī)基質(zhì)，將牙周膜纖維埋在有機(jī)基質(zhì)中，形成原發(fā)性牙骨質(zhì)[2-3]。

形態(tài)學(xué)上，上皮根鞘位于牙乳頭和牙囊之間，是二者的邊界，上皮-間充質(zhì)的相互作用對(duì)牙根形成有重要作用。上皮根鞘與間充質(zhì)的成牙本質(zhì)細(xì)胞與成牙骨質(zhì)細(xì)胞相互影響調(diào)控，共同調(diào)節(jié)根部牙本質(zhì)和牙骨質(zhì)的形成，從而調(diào)控牙根的發(fā)育，其中是通過(guò)復(fù)雜而精細(xì)的信號(hào)通路相互調(diào)控聯(lián)系的，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、刺猬家族蛋白（Shh）、Wingless（Wnt）、核因子I（NFI）家族成員C（Nfic）等，而這些信號(hào)通路的作用機(jī)制尚未明確[4]。

2 影響牙根發(fā)育的相關(guān)因子

2.1 Nfic/Osx轉(zhuǎn)錄因子

Nfic存在于牙根發(fā)育時(shí)期的牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，對(duì)根部牙本質(zhì)形成起到重要作用。Osx是一種含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在所有發(fā)育的骨骼中特異性表達(dá)，缺乏Osx的小鼠沒(méi)有骨組織的形成[5]。研究發(fā)現(xiàn)，Nfic的破壞會(huì)損壞成骨細(xì)胞的分化和骨組織的形成，而Nfic直接調(diào)節(jié)Osx的表達(dá)，Osx是BMP Runx-2的下游靶基因[6]。Runx-2主要調(diào)控早期的牙根發(fā)育，而Osx通過(guò)調(diào)控成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化從而影響牙根的后期發(fā)育[7-8]。

缺失Osx的斑馬魚突變體顯示牙本質(zhì)形成受阻，成牙本質(zhì)細(xì)胞極性消失，僅有一層薄薄的牙本質(zhì)形成。在突變體中，破骨細(xì)胞活性仍然存在，推測(cè)Osx缺失時(shí)，牙根發(fā)育的程序仍正常進(jìn)行，但此時(shí)形成的牙根缺乏附著骨及正常的方向，同時(shí)牙髓組織受損[9]。

為研究Nfic-Osx信號(hào)通路與牙根發(fā)育的關(guān)系，Kague等[9]敲除小鼠的Osx基因（與2.3 kb Col 1-Cre雜交），發(fā)現(xiàn)條件敲除小鼠細(xì)胞增殖增加，而牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白（DMP1和DSPP）表達(dá)顯著降低，導(dǎo)致成牙本質(zhì)細(xì)胞分化被抑制，形成了含有少量牙本質(zhì)小管的短而薄的牙根。Kim等[10]也研究了Osx在成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性失活的影響，研究發(fā)現(xiàn)，Osx條件敲除小鼠具有正常的冠部、短根以及較薄的根部牙本質(zhì)，牙根的延長(zhǎng)受到影響。證明，Osx影響牙根后期的發(fā)育，但跟牙冠的發(fā)育沒(méi)有關(guān)聯(lián)。除此之外，Osx不僅影響成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化與根部牙本質(zhì)的形成，也與成牙骨質(zhì)細(xì)胞的分化和牙骨質(zhì)的形成有關(guān)。Osx敲除小鼠的短而細(xì)長(zhǎng)的牙根或許可以為臨床上類似的牙齒疾病找出病因，從而提供治療的方向[7]。

2.2 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）

BMP信號(hào)通路在牙齒發(fā)育起始定位、形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮十分重要的作用，其配體、受體及靶基因的缺失都會(huì)引起牙齒發(fā)育發(fā)生明顯的缺陷[11]。牙根發(fā)育過(guò)程中，Bmp信號(hào)通路在調(diào)節(jié)HERS的形成和成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化時(shí)十分活躍，Bmp2，3，4和7在牙根發(fā)育起始時(shí)均有表達(dá)[12]。Bmp信號(hào)通路異?；蚱湎嚓P(guān)基因缺失可導(dǎo)致牙根發(fā)育異常。

β-連環(huán)蛋白調(diào)節(jié)成牙本質(zhì)細(xì)胞的增殖分化，小鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性基因Ctnnb1（編碼β-連環(huán)蛋白）缺失導(dǎo)致Bmp7表達(dá)升高，而BMP拮抗劑noggin和卵泡抑素的表達(dá)減少，同時(shí)HERS細(xì)胞中磷酸化Smad1/5/8的水平增加，Smad1/5/8是BMP的經(jīng)典依賴途徑，一系列的變化導(dǎo)致BMP7表達(dá)增多，最終觀察到小鼠HERS的連續(xù)性遭到破壞，證明β-連環(huán)蛋白在牙根發(fā)育的連續(xù)性方面起到重要作用[13]。

Noggin是BMP信號(hào)的一種蛋白抑制劑，對(duì)BMP有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，對(duì)Wnt有正反饋調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)BMP影響[14]。Harmine是一種天然的小型化合物，可在體內(nèi)或體外刺激成骨細(xì)胞分化，可誘導(dǎo)HERS、牙囊、牙乳頭細(xì)胞的smad1/5/8磷酸化，從而促進(jìn)HERS的延長(zhǎng)和牙囊及牙乳頭相關(guān)細(xì)胞的增殖分化。FGF2蛋白存在的情況下，BMP2可增多HERS細(xì)胞的分化，因此，F(xiàn)GF2蛋白可增強(qiáng)BMP2依賴的HERS細(xì)胞生長(zhǎng)。間充質(zhì)細(xì)胞的BMP2基因中敲除SP7可導(dǎo)致短而薄的牙根形成，且細(xì)胞牙骨質(zhì)形成失敗。HMN以劑量依賴性方式激活細(xì)胞增殖活性與FGF2蛋白協(xié)同作用，因此，HMN重復(fù)了BMP2-Smad1/5/8通路的一些生物學(xué)效應(yīng)從而影響牙根發(fā)育[9]。

2.3 Wnt信號(hào)通路

Wnt信號(hào)通路包括經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路、非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號(hào)通路和Wnt/PCP信號(hào)通路[10]。Wnt信號(hào)通路在牙根發(fā)育過(guò)程中有重要意義，而β-連環(huán)蛋白是Wnt信號(hào)通路經(jīng)典途徑的關(guān)鍵因子，對(duì)骨組織的形成至關(guān)重要[15]。

突變小鼠牙根成牙本質(zhì)細(xì)胞中Wnt10a和Axin2表達(dá)顯著降低。證明在成牙本質(zhì)細(xì)胞中刪除Wls基因似乎減少了經(jīng)典的Wnt活性，導(dǎo)致成牙本質(zhì)細(xì)胞成熟和牙根延長(zhǎng)受到抑制[16]。

經(jīng)典途徑的Wnt信號(hào)通路研究較多，而對(duì)非經(jīng)典途徑知之甚少。非經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)以多種方式抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。Wnt5a通過(guò)抑制β-連環(huán)蛋白/TCF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄下游的信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)抑制Wnt3a介導(dǎo)的ALP表達(dá)增加，Wnt5a由牙囊細(xì)胞和前體細(xì)胞/成牙骨質(zhì)細(xì)胞系細(xì)胞表達(dá)。此外，Wnt5a信號(hào)通路抑制Wnt3a介導(dǎo)的牙囊細(xì)胞中ALP表達(dá)的增加，表明Wnt5a在根形成期間對(duì)牙囊細(xì)胞的成牙本質(zhì)/成骨細(xì)胞分化中可能具有負(fù)調(diào)節(jié)作用[17]。

Wnt3a抑制成骨細(xì)胞分化，同時(shí)降低小鼠成骨細(xì)胞中Alp1和Osx的表達(dá)水平，誘導(dǎo)Runx2的轉(zhuǎn)錄活性以及小鼠牙囊細(xì)胞中ALP和Osx基因和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。Wnt3a是在牙根發(fā)育期間由HERS細(xì)胞分泌，牙囊中的Wnt信號(hào)通路通過(guò)Osx而不是Runx2來(lái)誘導(dǎo)早期的成牙骨質(zhì)細(xì)胞或成骨細(xì)胞分化[18]。

2.4 其他與牙根發(fā)育相關(guān)的基因

Wang等[19]將殼聚糖Clcn7-siRNA納米顆粒注射至新生小鼠的第一磨牙胚周圍作為實(shí)驗(yàn)組，結(jié)果導(dǎo)致牙齒萌出過(guò)遲和牙根發(fā)育異常。取E13.5 d小鼠的下頜第一磨牙牙胚，轉(zhuǎn)染Clcn7-siRNA慢病毒感染體，移植至腎被膜下，與Clcn7功能正常的牙胚比較，Clcn7功能障礙的牙胚中生成的牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)及牙周膜發(fā)生異常。這種牙齒的改變?cè)贑lcn7突變體病人中也有報(bào)道[20]。ClC-7的缺乏可能在以下幾個(gè)方面影響牙齒的發(fā)育和萌出：可能直接影響牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)的形成和鈣化；或者阻礙牙乳頭細(xì)胞的分化從而影響牙根的發(fā)育。

Btbd7基因是Onodera等[21]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的一種在胎兒發(fā)育期對(duì)唾液腺、肺分支形成具有重要作用的基因，可以促進(jìn)上皮組織重塑和分支器官形成。楊等[22]通過(guò)檢測(cè)Btbd7基因在SD乳鼠牙根不同發(fā)育階段的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Btbd7基因在SD乳鼠牙根發(fā)育期間于上皮根鞘組織中高表達(dá)，并且隨著上皮根鞘的成熟而逐漸減少。Btbd7基因在SD乳鼠牙根發(fā)育不同階段的上皮根鞘中以特異性的時(shí)間-空間模式表達(dá)，從而推測(cè)Btbd7基因可能參與SD乳鼠磨牙牙根分支的發(fā)育。

3 牙根發(fā)育與牙源性干細(xì)胞的聯(lián)系

研究牙根發(fā)育機(jī)制可為臨床上治療相關(guān)牙根發(fā)育異常的疾病提供治療方法，還可為牙再生指明方向。許多實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，部分牙根發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路可調(diào)節(jié)牙源性干細(xì)胞分化。牙根的發(fā)育模式比較特別，出生后甚至牙萌出后仍在繼續(xù)，所以參與此過(guò)程的牙源性干細(xì)胞在牙再生方面必定有重要作用[23]。牙源性干細(xì)胞都具有分化的能力，目前對(duì)成牙本質(zhì)分化能力研究較多的是根尖乳頭干細(xì)胞SCAP、牙髓干細(xì)胞DPSC、人類脫落乳牙干細(xì)胞hSHED等，許多實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明牙根發(fā)育機(jī)制相關(guān)信號(hào)通路可調(diào)節(jié)牙源性干細(xì)胞分化的能力。

作為由BMP2調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)orkhead c2（Foxc2）在成骨/牙齒發(fā)生中起主導(dǎo)作用，研究結(jié)果表明，F(xiàn)oxc2和BMP2在體外協(xié)同促進(jìn)SCAP的骨/牙源性分化和礦化[24]。另外，PLLA納米纖維微球（NF-MS）作為細(xì)胞傳遞載體與PLGA微球中BMP-2的控制釋放對(duì)誘導(dǎo)SCAP牙源性分化的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BMP2可明顯促進(jìn)SCAP的成牙本質(zhì)能力，在NF-MS模型上觀察到成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞和牙本質(zhì)樣組織形成[25]。BMP2與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF均在牙根發(fā)育和牙本質(zhì)形成中發(fā)揮重要作用，慢病毒載體介導(dǎo)的BMP2和VEGF基因共轉(zhuǎn)染顯著激活人SCAP的骨/牙源性分化[26]。以上實(shí)驗(yàn)均證明BMP2與SCAP分化能力密切相關(guān)。NOTCH信號(hào)在許多物種器官組織的形態(tài)發(fā)生中扮演了一個(gè)重要的角色，它促進(jìn)或者抑制細(xì)胞的繁殖，啟動(dòng)或阻止細(xì)胞的分化，決定了干細(xì)胞分化的類型。它也被認(rèn)為在牙齒發(fā)育、牙髓再生和創(chuàng)傷后的自我修復(fù)中起到重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，正在萌出的牙齒頸環(huán)中有NOTCH3表達(dá)，NOTCH3的作用可能是保持干細(xì)胞龕中細(xì)胞的未分化狀態(tài)。體外培養(yǎng)的SCAP表達(dá)了NOTCH3及其配體JAG1，證明NOTCH3可能在調(diào)控SCAP的特性和生物行為中發(fā)揮作用[27]。

DPSC的增殖分化潛能可觀，同時(shí)許多信號(hào)通路可增強(qiáng)其增殖分化效力。小分子和/或重組蛋白對(duì)Wnt/Notch信號(hào)傳導(dǎo)的短暫預(yù)處理可激活增強(qiáng)DPSC在培養(yǎng)中的干性和效力[28]。SOX2可能通過(guò)Wnt信號(hào)通路的激活和Wnt基因的上調(diào)促進(jìn)DPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化[29]。氫氧化鈣通過(guò)調(diào)節(jié)TNF-α影響NF-κB，p38MAPK和Wnt通路來(lái)促進(jìn)的人DPSCs成骨分化[30]。而SHED可成功誘導(dǎo)成功能性血管平滑肌細(xì)胞從而用于血管組織工程，并且該過(guò)程可通過(guò)TGF-β-1-ALK5信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)，這可能為血管組織工程提供新思路[31]。

在牙髓再生方面，許多體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)單個(gè)或多個(gè)信號(hào)通路可誘導(dǎo)人DPSCs和SCAP遷移、增殖和分化，這種“干細(xì)胞歸巢”的作用是實(shí)現(xiàn)牙髓再生的重要途徑。動(dòng)物和人體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同樣實(shí)現(xiàn)了牙髓再生，而且于個(gè)別實(shí)驗(yàn)對(duì)象中觀察到了神經(jīng)纖維和牙本質(zhì)樣組織的生成。然而這些技術(shù)尚不成熟，到最終應(yīng)用于人體、在臨床上推廣還有很長(zhǎng)的路要走[32]。牙根發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路精細(xì)而復(fù)雜，與牙源性干細(xì)胞的聯(lián)系也有許多待探究的空間。因牙源性干細(xì)胞來(lái)源簡(jiǎn)單可靠，研究其分化的機(jī)制、與牙根發(fā)育的關(guān)聯(lián)，可為如何將其有效率、低成本地應(yīng)用并推廣至臨床提供有力的基礎(chǔ)依據(jù)。與此同時(shí)，許多基礎(chǔ)研究為體外研究，研究對(duì)象基本集中于動(dòng)物，如何為干細(xì)胞發(fā)育提供適合的環(huán)境，研究結(jié)果能否應(yīng)用于人頜骨上，這仍是一個(gè)需要解決的難題[33]。

4 結(jié)論

綜上所述，牙根的發(fā)育機(jī)制雖然尚未被闡明，但越來(lái)越多的信號(hào)通路被研究發(fā)現(xiàn)。其中精細(xì)而復(fù)雜的聯(lián)系需要我們逐個(gè)探究解開謎底。牙源性干細(xì)胞應(yīng)用于牙根再生的組織工程炙手可熱，“干細(xì)胞歸巢”應(yīng)用于牙髓再生指日可待，但技術(shù)仍不夠成熟，且研究結(jié)果局限，這些難題仍有待解決。牙根的發(fā)育機(jī)制有待進(jìn)一步研究，這對(duì)指導(dǎo)牙源性干細(xì)胞應(yīng)用于牙根再生的組織工程有重要的理論和實(shí)踐意義。