陳晨,王琳晶,吳丹,呂曉琳,馮秋菊,黃樹明

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電針預(yù)處理對心肌缺血再灌注無復(fù)流大鼠NF-kB p65蛋白及其磷酸化水平的影響

陳晨1,王琳晶1,吳丹1,呂曉琳1,馮秋菊1,黃樹明2

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040)

觀察電針預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注無復(fù)流現(xiàn)象及核轉(zhuǎn)錄因子-kB(NF-kB) p65蛋白及其磷酸化水平的影響。48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、電針預(yù)處理組、阿托伐他汀預(yù)處理組。除假手術(shù)組外,其余各組大鼠均采用結(jié)扎左冠狀動脈45 min后再灌注120 min的方法復(fù)制急性心肌缺血再灌注無復(fù)流的模型。觀察各組大鼠心肌梗死、缺血及無復(fù)流的范圍,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清炎性因子白細(xì)胞介素-10(IL-10)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF-a)的水平,蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western-blot)測定心肌組織中NF-kB p65及其磷酸化水平的表達(dá)。與模型組比較,電針預(yù)處理組和阿托伐他汀預(yù)處理組心肌梗死范圍及無復(fù)流范圍明顯減小,電針預(yù)處理能顯著升高心肌梗死大鼠血清IL-10水平,降低血清IL-6及TNF-a水平,下調(diào)心肌組織中NF-kB p65及phospho-NF-kB p65蛋白的表達(dá),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。電針預(yù)處理能夠顯著降低心肌組織中NF-kB p65及其磷酸化水平的表達(dá),從而改善心肌缺血再灌注后的無復(fù)流現(xiàn)象。

電針;心肌再灌注損傷;無復(fù)流現(xiàn)象;NF-kB p65蛋白;大鼠

無復(fù)流現(xiàn)象(no-reflow, NR)是指急性心肌梗死冠脈再通后,缺血區(qū)血供重新恢復(fù)但心肌組織仍然處于低灌注、甚至無灌注狀態(tài)的一種現(xiàn)象[1]。調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),作為急性心肌梗死后的一個重要預(yù)測因子,約有30%～50%的患者在經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)后出現(xiàn)無復(fù)流現(xiàn)象[2]。因此有效地防治無復(fù)流現(xiàn)象的出現(xiàn)成為成功治療急性心肌梗死的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn),針灸能夠有效減輕缺血再灌注后的心肌損傷,但是目前尚無針灸防治缺血再灌注后無復(fù)流現(xiàn)象的報道[3-5]。本研究通過復(fù)制無復(fù)流大鼠模型,觀察大鼠炎性因子及心肌組織中NF-kB p65及其磷酸化水平的表達(dá),探討電針對心肌缺血再灌注無復(fù)流現(xiàn)象的影響及其部分作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

48只SPF級雄性SD大鼠,體質(zhì)量(280±15)g,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、電針預(yù)處理組和阿托伐他汀預(yù)處理組,每組12只,實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵照科技部(2006)398號《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》文件要求執(zhí)行[6]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 電針預(yù)處理組

將大鼠固定于實(shí)驗(yàn)臺上,將0.25 mm×25 mm的毫針刺入雙側(cè)內(nèi)關(guān)、心俞及膻中穴,穴位的選取參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]中相關(guān)穴位的定位方法取穴。內(nèi)關(guān)采用直刺法,心俞采用斜刺法,膻中采用平刺法,進(jìn)針后采用平補(bǔ)平瀉手法行針1 min后連接Han-200電針儀。連接方法,同側(cè)穴位以內(nèi)關(guān)連接心俞穴,膻中在其旁開0.5 cm處另刺入一針作為輔助電極,選連續(xù)波,頻率2 Hz,強(qiáng)度1 mA,每日1次,連續(xù)7 d。

1.2.2 阿托伐他汀預(yù)處理組

于造模前給予阿托伐他汀混懸液15 mg/kg灌胃,每日1次,連續(xù)7 d。

1.2.3 假手術(shù)組

給予等量的生理鹽水灌胃,每日1次,連續(xù)7 d。

1.2.4 模型組

給予等量的生理鹽水灌胃,每日1次,連續(xù)7 d。

1.3 模型制備

參照韋星等[8]方法,大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉后仰臥固定于動物實(shí)驗(yàn)臺上,氣管插管后并調(diào)整呼吸參數(shù)。于胸骨左緣第2至第4肋做一縱行切口,剪斷肋骨并充分暴露心包。剪開心包膜后并剔除心底的脂肪組織,用帶縫線的小圓針自肺動脈圓錐和左心耳處結(jié)扎冠狀動脈左前降支,假手術(shù)組只做穿線處置,而不結(jié)扎冠狀動脈。結(jié)扎處理45 min后松解結(jié)扎線以恢復(fù)血流,恢復(fù)灌注時間為120 min。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 缺血、梗死和無復(fù)流范圍

再灌注120 min后自尾靜脈注射硫磺素S(1 mL/kg)后結(jié)扎左灌注動脈前降支,自下腔靜脈注入2 mL 1%伊文斯藍(lán),1 min后取出心臟并沖洗,﹣80℃冰凍保存10 min后沿長軸方向以2 mm的間隔切片,置于熒光顯微鏡下拍照并保存。然后將心肌切片放入氯化三苯基四氮唑緩沖液中染色,掃描儀掃描并保存。分別計(jì)算各組大鼠心肌組織缺血率(RA=缺血面積÷左心室面積)、梗死率(IS=梗死面積÷缺血面積)和無復(fù)流率(ANR=無復(fù)流面積÷缺血面積)。

1.4.2 血清炎性因子

造模結(jié)束后于頸動脈插管采血,采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)測定大鼠血清炎性因子白細(xì)胞介素-10(Interleukin -10,IL-10)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF-a)的水平。

1.4.3 心肌組織中NF-kB p65蛋白

RIPA裂解液裂解左心室游離壁心肌組織,離心后取上清BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE電泳后將PVDF膜置于電泳轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡。封閉后加入一抗NF-kB p65、phospho-NF-kB p65、b-actin及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗。ECL顯影后拍照,以Image J軟件分析各組條帶,以b-actin為內(nèi)參,計(jì)算各蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間的比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用法。以＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠缺血、梗死和無復(fù)流范圍的比較

由表1可見,電針預(yù)處理組和阿托伐他汀預(yù)處理組大鼠心肌缺血范圍較模型組減小,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05);心肌梗死范圍及無復(fù)流范圍較模型組明顯減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。

表1 各組大鼠缺血、梗死和無復(fù)流范圍的比較 (±s,%)

注:與假手術(shù)組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

2.2 各組大鼠血清炎性因子水平的比較

造模后大鼠血清IL-10水平顯著增高,血清IL-6及TNF-a水平增高,與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01);電針預(yù)處理和阿托伐他汀預(yù)處理組能夠顯著升高心肌梗死大鼠血清IL-10水平,降低血清IL-6及TNF-a水平,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。詳見表2。

表2 各組大鼠血清炎性因子水平的比較 (±s,pg/mL)

注:與假手術(shù)組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

2.3 各組大鼠心肌組織中NF-kB p65蛋白表達(dá)的比較

造模后大鼠心肌組織中NF-kB p65及phospho- NF-kB p65蛋白表達(dá)顯著增加,與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01);電針預(yù)處理和阿托伐他汀預(yù)處理組能夠顯著降低心肌組織中NF-kB p65及phospho- NF-kB p65蛋白的表達(dá),與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠心肌組織中NF-kB p65蛋白表達(dá)的比較 (±s)

注:與假手術(shù)組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01,3)＜0.05

3 討論

再灌注無復(fù)流是指血管再通后雖無機(jī)械性梗阻,仍存在心肌有效灌注不足的一種現(xiàn)象,其不僅顯著增加心肌再梗死率,還能引起心源性猝死和心室重構(gòu)等嚴(yán)重不良后果[9]。NR病理機(jī)制復(fù)雜,但是越來越多的研究發(fā)現(xiàn),其與炎癥反應(yīng)存在密切的關(guān)系[10-11]。心肌缺血能夠誘導(dǎo)心肌和血管內(nèi)皮細(xì)胞的腫脹,當(dāng)再灌注時產(chǎn)生大量的氧自由基,從而趨化白細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)釋放多種炎癥介質(zhì),引起微循環(huán)的阻塞和毛細(xì)血管通透性增加,最終導(dǎo)致無復(fù)流的發(fā)生。IL-6和TNF-a作為重要的促炎性細(xì)胞因子,與心肌缺血及再灌注密切相關(guān),能夠通過趨化、激活中性粒細(xì)胞促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)展,介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、微循環(huán)的損傷,從而加重再灌注損傷和無復(fù)流的發(fā)生[12-17]。IL-10主要由T淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,其能夠通過抑制IL-6、TNF-a的產(chǎn)生從而調(diào)控炎癥反應(yīng),是當(dāng)前備受關(guān)注的抗炎介質(zhì)之一[18-19]。研究證實(shí),在缺血再灌注的早期即可產(chǎn)生大量的IL-10,通過抑制心肌組織中性粒細(xì)胞的聚集,起到保護(hù)作用[20-22]。

治未病是中醫(yī)藥防病保健的理論基礎(chǔ),早在《針灸聚英》中就有針灸預(yù)處理治未病的記載“無病而先針灸曰逆。逆,未至而迎之也”。盡管近年來研究發(fā)現(xiàn),針灸的雙向良性調(diào)節(jié)作用在機(jī)體處于穩(wěn)態(tài)時,其興奮性或抑制性效應(yīng)都相對微弱或者不明顯,但是針灸的適宜刺激,能夠通過穩(wěn)定和增強(qiáng)器官的系統(tǒng)機(jī)能和抗擾動能力,達(dá)到防病保健的目的[23-26]。如同心肌缺血預(yù)適應(yīng)一樣,研究發(fā)現(xiàn)針灸預(yù)處理能夠有效推遲心肌梗死發(fā)生的時間,減少梗死的范圍,還能夠降低室性心律失常的發(fā)生及程度,達(dá)到內(nèi)源性的保護(hù)作用[27]。生物膜通透性增加引起的細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的破壞,在再灌注的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用[28]。研究發(fā)現(xiàn),電針預(yù)處理參與了細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié),這可能是針灸防治缺血再灌注損傷的內(nèi)源性機(jī)制之一[29]。

本研究采用結(jié)扎冠狀動脈后恢復(fù)血流復(fù)制心肌缺血再灌注無復(fù)流模型,通過電針內(nèi)關(guān)、心俞及膻中穴進(jìn)行預(yù)處理。內(nèi)關(guān)穴為八脈交會穴之一,又是手厥陰心包經(jīng)的絡(luò)穴。有動物研究發(fā)現(xiàn),電針內(nèi)關(guān)穴能夠上調(diào)心肌d阿片受體基因的表達(dá),從而起到保護(hù)心肌再灌注損傷的作用,減少心肌梗死的范圍[30]。心俞穴屬于足太陽膀胱經(jīng)穴,心之背俞穴,具有通絡(luò)安神、寬胸理氣的作用。宋春華等[31]研究發(fā)現(xiàn),電針心俞穴預(yù)處理能夠有效減少再灌注大鼠一氧化氮及過氧化氫酶含量,從而起到保護(hù)心肌的作用。膻中穴屬于任脈的經(jīng)穴,為八會穴之氣會。研究發(fā)現(xiàn),膻中穴具有舒張血管平滑肌、擴(kuò)張冠狀動脈的功能[32]。筆者的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針能夠顯著減少心肌梗死及再灌注無復(fù)流的范圍,并且能夠調(diào)控大鼠血清抗炎因子和促炎因子的水平。NF-kB作為炎癥反應(yīng)的始動環(huán)節(jié),能夠調(diào)控下游炎性因子的表達(dá),對再灌注后無復(fù)流的發(fā)展起著重要的作用[33-37]。本研究通過檢測心肌組織中NF-kB p65蛋白及其磷酸化水平發(fā)現(xiàn),電針預(yù)處理能夠顯著下調(diào)NF-kB p65及phospho-NF-kB p65蛋白的表達(dá)。

綜上所述,電針內(nèi)關(guān)、心俞、膻中能夠改善心肌缺血再灌注后的無復(fù)流現(xiàn)象,其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控NF-kB p65蛋白磷酸化水平,從而調(diào)控下游炎性因子的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

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The Effect of Electroacupuncture Pretreatment on NF-kB p65 and Its Phosphorylation Levels in Rats with Myocardial No-reflow After Ischemia-reperfusion

1,-1,1,-1,-1,-2.

1.,150001,; 2.,150040,

To observe the effect of electroacupuncture pretreatment on myocardial no-reflow after ischemia-reperfusion, NF-kB p65 and its phosphorylation levels in rats.Forty-eight male SD rats were randomized to sham operation, model, electroacupuncture pretreatment and atorvastatin pretreatment groups. A model of myocardial no-reflow after acute ischemia-reperfusion was made in all the groups except the sham operation group. The model was made by left coronary artery ligation for 45 min and subsequent reperfusion for 120 min. The extents of myocardial infarct, ischemia and no-reflow were assessed in every group of rats. Serum inflammatory factors interleukin-10 (IL-10), interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor (TNF-a) levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Myocardial expressions of NF-kB p65 and phospho-NF-kB p65 were determined by Western blot.The extents of myocardial infarct and no-reflow were significantly reduced in the electroacupuncture pretreatment and atorvastatin pretreatment groups compared with the model group. Electroacupuncture pretreatment could significantly raise serum IL-10 levels, reduce serum IL-6 and TNF-alevels and down-regulate myocardial expressions of NF-kB p65 and phospho-NF-kB p65 with statistically significant differences (＜0.01,＜0.05).Electroacupuncture pretreatment can significantly decrease myocardial expressions of NF-kB p65 and phospho-NF-kB p65 to reduce myocardial no-reflow after ischemia-reperfusion.

Electroacupuncture; Myocardial reperfusion injury; No-reflow phenomenon; NF-kB p65; Rats

1005-0957(2019)03-0336-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2019.03.0336

2018-11-07

黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目(QC2017118);黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)科研基金項(xiàng)目(201710)

陳晨(1985—),男,主治醫(yī)師,碩士,Email:cc13936695663@163.com

黃樹明(1958—),男,教授,博士生導(dǎo)師,博士,Email:huangsm1958@163.com