金禹彤,吳凌韜,陳姍,宣麗華

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不同時(shí)間穴位貼敷對過敏性哮喘大鼠免疫指標(biāo)的影響

金禹彤1,吳凌韜1,陳姍1,宣麗華2

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué),杭州 310053;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,杭州 310006)

觀察不同時(shí)間穴位貼敷對過敏性哮喘大鼠行為學(xué)及血清免疫球蛋白E(IgE)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)和干擾素-g(IFN-g)水平的影響,探討穴位貼敷治療哮喘的作用機(jī)制。50只Wistar雄性大鼠按體重采用隨機(jī)數(shù)字表法分為A組(正常對照組)、B組(哮喘模型組)、C組(地塞米松組)、D組(穴位貼敷2 h組)和E組(穴位貼敷4 h組)。以雞卵白蛋白(OVA)制備大鼠哮喘模型,14 d后各組分別給予相應(yīng)治療。觀察大鼠治療前后引喘潛伏期和發(fā)作總持續(xù)時(shí)間變化;采用HE染色檢測大鼠肺組織病理改變,ELISA法測血清中IgE、IL-4和IFN-g水平變化。與A組比較,B組引喘潛伏期顯著縮短、發(fā)作持續(xù)時(shí)間顯著延長(＜0.05);病理顯示肺組織炎癥明顯;IgE、IL-4顯著升高,IFN-g顯著降低(＜0.05)。與B組比較,C組、D組、E組治療后引喘潛伏期明顯延長、哮喘發(fā)作持續(xù)時(shí)間明顯縮短(＜0.05);肺病理組織觀察顯示穴位貼敷后支氣管及肺實(shí)質(zhì)炎性改變顯著改善;血清中IgE和IL-4水平顯著降低,IFN-g水平顯著升高(＜0.05)。D組、E組各指標(biāo)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。穴位貼敷可以通過改善肺組織炎癥,減低IgE、IL-4,升高IFN-g的表達(dá)來治療哮喘,且不同貼敷時(shí)間對治療效果無明顯影響。

穴位貼敷法;哮喘;大鼠;IgE;IL-4;IFN-g

過敏性哮喘是一種由肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)性疾病,全球約有3億哮喘患者,各國哮喘患病率1%～30%不等,中國約為0.5%～5%,且呈逐年上升趨勢[1]。目前常用治療方法為b2腎上腺素受體激動劑、茶堿類藥物及小劑量糖皮質(zhì)激素等,可局部抗炎且起效迅速,它雖然可以有效地控制哮喘發(fā)作,但長期應(yīng)用可引起骨質(zhì)疏松等不良反應(yīng)[2]。穴位貼敷是傳統(tǒng)的中醫(yī)外治療法,也是臨床治療過敏性哮喘的常用方法,且安全無不良反應(yīng)。目前對于穴位貼敷治療哮喘的研究多集中于不同穴位、不同藥物對于療效的影響[3-4],本實(shí)驗(yàn)從不同貼敷時(shí)間入手明確貼敷時(shí)間與療效的關(guān)系,并從病理及免疫方面探討其相關(guān)機(jī)制,為臨床治療選擇適宜貼敷時(shí)間提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級Wistar雄性大鼠50只,體重160～200 g,6周齡,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供,使用許可證號SYXK(浙)2013-0184,嚴(yán)格遵照“實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境及設(shè)施GB14925-2001”,并遵守動物倫理和福利原則,方案通過學(xué)校實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。大鼠分籠飼養(yǎng)在濕度60%～70%、室溫21～25℃環(huán)境中,12 h晝夜節(jié)律,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后使用。

1.2 主要試劑和儀器

卵白蛋白OVA(美國Sigma公司,高純,金標(biāo)級);氫氧化鋁凝膠(美國Sigma公司);地塞米松注射液(江西博萊大藥廠有限公司);IgE、IL-4和IFN-g的ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物公司);超生霧化器;自制玻璃箱。穴位貼敷貼膏由中藥白芥子、延胡索、細(xì)辛、甘遂、冰片按照1:1:0.5:0.5:0.1比例組成(浙江省中醫(yī)院自制)。

1.3 大鼠哮喘模型制備

50只Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組,A組(正常對照組)、B組(哮喘模型組)、C組(地塞米松組)、D組(穴位貼敷2 h組)和E組(穴位貼敷4 h組),每組10只。除A組外各組參照改良Palmans方法[5]致敏建立哮喘模型。每只造模大鼠第1天和第8天皮下多點(diǎn)注射含10 mg OVA和100 mg Al(OH)3的1 mL生理鹽水混懸液致敏,第15天開始放入透明玻璃箱內(nèi),用1%的OVA生理鹽水溶液激發(fā)哮喘,每次30 min,隔日1次。直至第56天霧化結(jié)束。

最后一次霧化觀察造模后大鼠,當(dāng)其出現(xiàn)打噴嚏、腹式呼吸明顯、四肢無力癱軟、鼻癢抓鼻、反應(yīng)遲鈍等癥狀視為激發(fā)成功,并將大鼠肺部做病理切片HE染色后進(jìn)一步確定造模成功。

1.4 治療方法

第56天所有造模結(jié)束后,大鼠正常飼養(yǎng)14 d,待其進(jìn)入緩解期。第15天起分組治療。A組、B組正常飼養(yǎng);C組腹腔注射地塞米松,隔日1次,每次0.5 mg/kg;D組、E組大鼠背部剃毛,并在其雙側(cè)肺俞、脾俞、腎俞(定位參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6])貼敷0.8 cm×0.8 cm的膏藥,膠布固定,D組2 h后取下膏藥,E組4 h后取下膏藥,隔日1次,共7次。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 行為學(xué)觀察

從霧化開始到大鼠出現(xiàn)噴嚏、抓鼻、腹式呼吸明顯等表現(xiàn)的最短時(shí)長為引喘潛伏期,霧化期間出現(xiàn)這些表現(xiàn)的持續(xù)時(shí)間總和為發(fā)作總持續(xù)時(shí)間。造模第56天將所有大鼠用OVA生理鹽水溶液霧化激發(fā)30 min,其間觀察大鼠引喘潛伏期和發(fā)作總持續(xù)時(shí)間并記錄。最后1次治療結(jié)束后2 h再次將所有大鼠用OVA生理鹽水溶液霧化激發(fā)30 min,觀察并記錄以上指標(biāo)。

1.5.2 血清指標(biāo)檢測

治療結(jié)束后12 h,取1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。各組大鼠心臟取血5 mL,靜置2 h,以3000 r/min離心10 min,標(biāo)號后取上清液,放置﹣70℃冰箱保存。ELISA法檢測各組大鼠血清中免疫球蛋白E(IgE)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)和干擾素-g(IFN-g)水平,步驟嚴(yán)格遵循ELISA試劑盒說明。

1.5.3 肺組織病理檢測

大鼠取血結(jié)束后脫頸處死,取右肺組織,用4℃生理鹽水漂洗干凈,置于10%中性甲醛中固定24 h[7],石蠟包埋、切片并HE染色,置于光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理改變情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(AVONA),均數(shù)間兩兩比較采用檢驗(yàn)。以＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穴位貼敷對哮喘大鼠引喘潛伏期與發(fā)作總持續(xù)時(shí)間影響

從表1可見,治療前后B組在引喘潛伏期上短于A組,發(fā)作持續(xù)時(shí)間長于A組(＜0.05),說明哮喘模型造模成功;治療前B組、C組、D組和E組引喘潛伏期和發(fā)作總持續(xù)時(shí)間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。治療后C組、D組、E組引喘潛伏期長于B組、發(fā)作持續(xù)時(shí)間短于B組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05),說明地塞米松和穴位貼敷對過敏性哮喘治療效果顯著;治療后D組和E組在引喘潛伏期和發(fā)作總持續(xù)時(shí)間上比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。

表1 各組大鼠治療前后引喘潛伏期與發(fā)作總持續(xù)時(shí)間變化 (±s,s)

注:與A組比較1)＜0.05;與B組比較2)＜0.05

2.2 各組大鼠血清IgE、IL-4、IFN-g水平比較

與A組比較,B組大鼠血清中IgE、IL-4水平升高, IFN-g水平降低(＜0.05);與B組比較,C組、D組、E組大鼠血清中IgE、IL-4含量降低,IFN-g含量升高(＜0.05);D組和E組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠血清IgE、IL-4、IFN-g水平比較 (±s)

注:與A組比較1)＜0.05;與B組比較2)＜0.05

2.3 肺組織結(jié)構(gòu)觀察

HE染色的肺組織病理切片顯示,A組肺實(shí)質(zhì)無明顯炎性改變,肺泡結(jié)構(gòu)基本完整,肺泡周圍有極少量炎性細(xì)胞浸潤。B組肺組織結(jié)構(gòu)不清,支氣管壁黏膜水腫,肺泡內(nèi)和肺泡間隔見明顯炎性細(xì)胞浸潤。C組、D組、E組肺組織結(jié)構(gòu)相對清晰,肺泡內(nèi)及周圍黏膜水腫減少,肺組織炎癥有所減輕,炎性細(xì)胞浸潤減少。詳見圖1。

3 討論

過敏性哮喘發(fā)病機(jī)制至今未完全明確,可能為多種機(jī)制引起的一種共同反應(yīng)。大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明,其發(fā)生發(fā)展與免疫和變態(tài)反應(yīng)、氣道炎癥、神經(jīng)調(diào)節(jié)以及氣道高反應(yīng)密切相關(guān)[8]。

眾所周知,過敏性哮喘屬于Ⅰ型超敏反應(yīng)中的一種,由IgE介導(dǎo)產(chǎn)生。有研究表明,哮喘的發(fā)生與患者接觸過敏原后血清總IgE及過敏原特異性IgE的升高密切相關(guān)[9-10],變應(yīng)原通過吸入等途徑進(jìn)入易感者體內(nèi),在巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的協(xié)助下,由B淋巴細(xì)胞合成IgE抗體并進(jìn)入致敏狀態(tài),當(dāng)相同的過敏原再次進(jìn)入機(jī)體,機(jī)體將啟動免疫應(yīng)答反應(yīng),結(jié)合細(xì)胞表面的IgE抗體,使肥大細(xì)胞及嗜酸粒細(xì)胞增多并脫顆粒,產(chǎn)生多種炎癥因子,從而引起氣道炎癥反應(yīng)激發(fā)哮喘。

圖1 大鼠肺病理形態(tài)(HE,×200)

IL-4和IFN-g與IgE水平密切相關(guān),在哮喘發(fā)病過程中起至關(guān)重要的作用。IL-4是由CD4﹢細(xì)胞分泌的一種活性細(xì)胞因子[8],主要功能為促進(jìn)B細(xì)胞分化、增殖和活化,促使Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化,同時(shí)誘導(dǎo)IgG向IgE轉(zhuǎn)化。1986年Coffman RL等[11]首先證實(shí)IL-4可誘導(dǎo)小鼠B細(xì)胞合成IgE,Kubo M[12]研究證實(shí)IL-4主要由Th2細(xì)胞介導(dǎo)釋放,可以引起IgE水平的升高,產(chǎn)生過敏反應(yīng)。IFN-g主要來源于CD8﹢細(xì)胞,可以通過抑制IL-4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平拮抗IL-4,從而抑制體內(nèi)IgE的產(chǎn)生。Ma L等[13]的證明,疫苗可通過升高IFN-g水平以降低血清IgE水平來治療過敏性哮喘。Mitchell C等[14]發(fā)現(xiàn)IFN-g能明顯抑制由IL-4誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖,減輕氣道炎性反應(yīng),降低氣道的阻塞程度。徐文中等[15]發(fā)現(xiàn)血清IgE、IL-4和IFN-g與患者的過敏性鼻炎發(fā)病有關(guān)。

穴位貼敷療法在治療哮喘方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢,其可溫經(jīng)通絡(luò),散寒止痛,調(diào)節(jié)人體陰陽平衡,并提高人體自身防病抗病的能力。臨床及實(shí)驗(yàn)研究證明,穴位貼敷可以通過調(diào)節(jié)免疫、改善炎癥等相關(guān)機(jī)制治療過敏性哮喘[16-22]。陳曉勤等[23-24]研究發(fā)現(xiàn)“陽虛哮喘敷貼方”可以下調(diào)人體內(nèi)的免疫球蛋白IgE的含量,從而緩解哮喘癥狀。高修安等[25]在涌泉穴貼敷海龍蠲哮方合咳喘平,證明其可以通過降低IgE、減少炎性細(xì)胞數(shù)量來緩解肺組織炎癥,治療兒童哮喘。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,過敏性哮喘大鼠給予地塞米松及穴位貼敷治療均可有效降低其血清IgE和IL-4濃度,升高IFN-g濃度,減少免疫反應(yīng)及炎性細(xì)胞浸潤,從而改善哮喘癥狀,為穴位貼敷治療過敏性哮喘提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

此外,實(shí)驗(yàn)觀察顯示,穴位貼敷4 h組大鼠的皮膚反應(yīng)較穴位貼敷2 h嚴(yán)重,在臨床中反應(yīng)為患者皮膚發(fā)紅,甚至有水泡、膿包等表現(xiàn)。但結(jié)果表明穴位貼敷2 h與穴位貼敷4 h組在治療支氣管哮喘方面均有明顯的效果,且在行為學(xué)評價(jià)、病理觀察及血清IgE、IL-4和IFN-g指標(biāo)上兩者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。傳統(tǒng)的穴位貼敷理念認(rèn)為,將貼敷時(shí)間延長而使皮膚達(dá)到發(fā)紅甚至起泡狀態(tài)時(shí)療效較好。但在臨床治療過程中,有部分患者對于由于貼敷時(shí)間過長而出現(xiàn)的皮膚水泡等情況難以接受,甚至因此而中斷治療。此研究結(jié)果顯示,不同的貼敷時(shí)間對于哮喘治療效果及血清中的免疫指標(biāo)影響并不顯著。因此,根據(jù)患者的具體情況選擇適當(dāng)?shù)馁N敷時(shí)間,進(jìn)行多靶點(diǎn)小劑量的刺激,既可以保證患者治療哮喘的療效,同時(shí)又可以減輕患者痛苦,可用于指導(dǎo)臨床。

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Effect of Acupoint Application at Different Time Points on the Immune Indexes in Allergic Asthma Rats

-1,-1,1,-2.

1.,310053,; 2.,310006,

To observe the effect of acupoint application at different time points on the behaviors and levels of immunoglobulin E (IgE), interleukin (IL)-4 and interferon (IFN)-gin allergic asthma rats, and to discuss the mechanism of acupoint application in treating asthma.Based on the body weight, fifty male Wistar rats were divided by the random number table into group A (normal control group), group B (asthma model group), group C (dexamethasone group), group D (acupoint application 2 h group) and group E (acupoint application 4 h group). Asthma rat model was developed received corresponding intervention 14 d later. The attack latency and duration were observed before and after the intervention; HE staining was used to detect the pathological changes in lung tissues; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to examine the changes in serum levels of IgE, IL-4 and IFN-g.Compared with group A, the asthma attack latency was significantly shortened and the attack duration was significantly extended in group B (＜0.05); pathological analysis showed obvious pulmonary inflammation; the levels of IgE and IL-4 increased markedly and the level of IFN-gdecreased significantly (＜0.05). Compared with group B, the attack latency was significantly extended and the duration was markedly shortened in group C, D and E (＜0.05); pathological analysis revealed improved bronchial and pulmonary inflammation; the serum levels of IgE and IL-4 decreased significantly and the level of IFN-gincreased significantly (＜0.05). There were no significant differences in the indexes between group D and E (＞0.05).Acupoint application can treat asthma through improving pulmonary inflammation, down-regulating IgE and IL-4 and up-regulating IFN-g, and different application time does not have significant impact on the treatment result.

Acupoint sticking therapy; Asthma; Rats; IgE; IL-4; IFN-g

1005-0957(2019)03-0331-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2019.03.0331

2018-07-13

浙江省重大科技專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目(2014C03046-2)

金禹彤(1991—),女,2016級博士生,Email:379757201@qq.com

宣麗華(1960—),女,教授,Email:xlh1083@163.com