蘇日娜，牧 丹，那生桑

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

紫草為中醫(yī)和蒙醫(yī)常用藥材，最早載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歷代本草均有收載。2015年版中國(guó)藥典收載了紫草科軟紫草屬植物新疆紫草(Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst)和內(nèi)蒙紫草(ArnebiaguttataBunge)的干燥根，具有清熱涼血、活血解毒、透疹消斑的功效，用于治療血熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、瘡瘍、濕疹、水火燙傷[1]。

蒙醫(yī)藥中常稱紫草為畢日木格(《認(rèn)藥白晶鑒》)，蒙醫(yī)藥古籍均有記載?！稛o誤蒙藥鑒》載其：“生于砂質(zhì)硬土地，莖、葉具毛、葉灰色粗糙，根深紅棕色、味甘、澀者性烈，質(zhì)佳……根極細(xì)，叫吉木格者次?！鄙鲜鲋参锷场⑿螒B(tài)特征與蒙醫(yī)所沿用的紫草環(huán)境、形態(tài)特征基本一致，故認(rèn)定歷代蒙醫(yī)藥文獻(xiàn)所載的東日拉即畢日木格[2]。與中醫(yī)的炮制方法不同[3]，紫草油和紫草膏在蒙醫(yī)藥中的炮制方法主要有奶煮或泡、制炭?jī)煞N，這兩種炮制品藥理功效不同。《蒙藥炮制學(xué)》記載：“紫草的奶炮制品可增強(qiáng)肺熱的治療功效，紫草炭制后有助于治療各種原因引起的出血癥?！盵4，5]本研究以傳統(tǒng)蒙醫(yī)炮制理論為基礎(chǔ)，將紫草生品經(jīng)牛奶炮制后，測(cè)定其有效成分的含量，并考察炮制前后的含量變化，為今后蒙醫(yī)藥中紫草奶炮制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及藥理實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

1 儀器、試藥及藥材

1.1 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE52CS9(上海亞榮生化儀器廠)；KH5200DE型數(shù)控超聲儀(昆山禾創(chuàng)超神儀器有限公司)；SHB-B95T型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；恒溫水浴鍋B-220(上海亞榮生化儀器廠)；薄層色譜展開缸(上海信誼儀器廠有限公司)；硅膠板G(青島硅創(chuàng)精細(xì)化工有限公司)；玻璃毛細(xì)管(華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)； TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；Ichromw5100(大連依利特分析儀器有限公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品阿卡寧(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111689-201504)；新疆紫草(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121430-201504)；甲酸、甲醇和乙腈為分析純；石油醚(60～90℃)為分析純；水為Milli-Q超純水。

1.3 采集的藥材

全部批次的藥材經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)渠弼教授鑒定為紫草科植物新疆紫草(Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst.)的干燥根。見表1。

表1 采購(gòu)的紫草批號(hào)和產(chǎn)地

2 方法與結(jié)果

2.1 紫草奶炮制工藝流程

取新疆紫草500 g，加10倍鮮牛奶(500 mL)，煮沸。待煮到10 min后較粗的藥材完全煮透，藥材顏色變淺；將煮好的藥材轉(zhuǎn)移到燒杯中，用蒸餾水反復(fù)清洗至沒有奶漬；將清洗好的藥材放置于濾紙上鋪平，放到60 ℃的烘干箱中進(jìn)行烘干，直到干燥程度與原藥材相同為止。

按煎煮時(shí)間為指標(biāo)，分別測(cè)定煎煮10 min、15 min、20 min和30 min的炮制品中β,β′二甲基丙烯酰阿卡寧的含量，含量隨煎煮時(shí)間增加而降低，因?yàn)?0 min內(nèi)牛奶已經(jīng)浸透到全部藥材內(nèi)部(包括最粗的根狀藥材)，所以選擇10 min的炮制時(shí)間。

關(guān)于加入的牛奶量，根據(jù)文獻(xiàn)記載，10 kg的藥材浸泡要15 L的牛奶(1.5倍)。但在實(shí)驗(yàn)室炮制50 g的時(shí)候，若只是加入75 mL牛奶，則不能完全浸泡藥材，所以增加了牛奶的量。炮制后的藥材具有奶香味。

2.2 薄層鑒別

2.2.1 實(shí)驗(yàn)方法 取炮制品粉末0.5 g，加石油醚(60～90 ℃)20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。另取紫草對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121430-201504)0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(2015版藥典通則0502)試驗(yàn)，吸取兩種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶5∶0.5∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點(diǎn)；再噴以10% 氫氧化鉀甲醇溶液，斑點(diǎn)變?yōu)樗{(lán)色。見圖1。

圖1 薄層色譜

3 含量測(cè)定

3.1 羥基萘醌總色素

取本品適量，在50 ℃干燥3 h，粉碎(過三號(hào)篩)，取約0.5 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加乙醇至刻度，4 h內(nèi)連續(xù)振搖，濾過。精密量取續(xù)濾液5mL，置25mL量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻。照紫外-可見分光光度法(通則0401)，在516 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，按左旋紫草素(C16H16O5)的吸收系數(shù)E=242計(jì)算，即得。本品含羥基萘醌總色素以左旋紫草素(C16H16O5)計(jì)。見表2。

表2 新疆紫草不同樣品炮制前后羥基萘醌總色素含量變化 (%)

3.2 β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧的含量測(cè)定

3.2.1 色譜條件 色譜柱：Sinochrom ODS-BP(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相:乙腈-0.15%甲酸水溶液(70∶30),流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm；柱溫：30℃。β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111689-201504)。見圖2。

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制 稱定阿卡寧對(duì)照品6.23 mg置于10 mL容量瓶中，用乙醇溶液溶解并定容至刻度，搖勻，作為1號(hào)對(duì)照品；吸取1號(hào)對(duì)照品溶液5 mL，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻，作為2號(hào)對(duì)照品溶液；吸取2號(hào)對(duì)照品溶液2.5 mL轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻，作為3號(hào)對(duì)照品溶液；吸取3號(hào)對(duì)照品溶液2.5 mL，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻，作為4號(hào)對(duì)照品溶液；吸取4號(hào)對(duì)照品溶液2.5 mL轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻，作為5號(hào)對(duì)照品溶液。上述阿卡寧對(duì)照品溶液的濃度依次為1號(hào)0.632 mg/mL,2號(hào)0.316 mg/mL,3號(hào)0.079 mg/mL,4號(hào)0.02 mg/mL，5號(hào)0.002 mg/mL。

3.2.4 供試品溶液的制備 取本品粉末(過四號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入石油醚(60～90℃)25 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率33kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用石油醚(60～90℃)補(bǔ)足減少的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。見圖3。

3.3 專屬性考察

圖2、圖3為對(duì)照品及奶紫草的HPLC色譜，結(jié)果表明丙烯酰阿卡寧保留時(shí)間一致，分離度良好，HPLC測(cè)定方法專屬性良好。

圖2 β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧對(duì)照品的HPLC色譜

圖3 奶紫草的HPLC色譜

3.4 重現(xiàn)性考察

取同一批新疆紫草奶炮制樣品粉末(批號(hào)：1606102101)6份，精密稱定，按上述方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液20 μL，分別進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜，計(jì)算含量。結(jié)果，β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧含量的RSD=2.71%。見表3。

表3 重復(fù)性考察結(jié)果

3.5 穩(wěn)定性考察

精密吸取同一新疆紫草供試品溶液(批次：1606102101)20 μL，分別于0、1、2、4、8、12 h按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果，β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧的峰面積的RSD=0.78%。

3.6 線性范圍

精密稱取β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧6.32 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，既得0.632 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。用甲醇稀釋配制成濃度為0.316 mg/mL、0.076 mg/mL、0.02 mg/mL、0.002 mg/mL的一系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。濾頭過濾，吸取20 μL，按上述色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度(X)為 橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得線性方程為Y=2295 2X+33.915(r=0.999 9)。

3.7 加樣回收率

取已知含量的奶紫草粉末約0.25 g，共6份，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加入一定量的對(duì)照品，使供試品中待測(cè)定組分含有量與對(duì)照品的加入量比值在1∶1.5、1∶1、1∶0.5左右，按上述方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液20 μL，分別進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜，計(jì)算含量。結(jié)果見表4。

3.8 樣品含量測(cè)定

6個(gè)批次樣品各取3份，精密稱定，按上述方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液20 μL，分別用外標(biāo)法計(jì)算出6個(gè)批次樣品中β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧的含量。結(jié)果見表6。

4 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，紫草中主要活性成分為羥基萘醌色素類成分，包括紫草素及其衍生物，這類物質(zhì)主要有抗炎、抗菌、抗病毒等作用[6]。針對(duì)紫草的質(zhì)量控制研究有一些報(bào)道，郝鶴等[7]采用梯度洗脫 HPLC 法測(cè)定了新疆紫草中的7種萘醌類成分；Min Cheng 等[8]采用HPLC法測(cè)定了新疆紫草和內(nèi)蒙紫草中的左旋紫草素和 β，β′- 二甲基丙烯酰阿卡寧的含量，并對(duì)其進(jìn)行了分析；毛艷和 MEI LIAO 等[9,10]采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)紫草藥材的化學(xué)成分進(jìn)行了快速鑒定。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果

經(jīng)過牛奶炮制后的紫草生品，薄層鑒別結(jié)果表明其萘醌成分沒有明顯變化，而高效液相法定量分析后發(fā)現(xiàn)炮制品的紫草素類化合物峰的含量均比生品降低。其中以β，β′- 二甲基丙烯酰阿卡寧對(duì)照品，測(cè)定炮制品的羥基萘醌總色素的含量為0.56%～2.5% ；β，β’-二甲基丙烯酰阿卡寧的含量為0.020%～0.52%，分別比生品低1.7%～4.2%和0.07%～0.34%。2015版藥典中記載的紫草含量測(cè)定方法通過方法學(xué)考證適用于紫草的奶炮制品。為今后的蒙醫(yī)藥中紫草的奶炮制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及藥理實(shí)驗(yàn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。