李妹珍，陳鋒燁，馮毅凡，吳 霞

(廣東藥科大學 中心實驗室，廣東 廣州 510006)

知母(AnemarrhenaeRhizoma) 為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.) 的干燥根莖，味苦，性寒，歸肺、胃、腎經(jīng)?，F(xiàn)代藥理學研究表明，知母具有清熱、抗炎、抗感染、抗腫瘤、抗真菌等多種藥理活性[1-2]。知母根莖中含有大量甾體皂苷、雙苯吡酮類、黃酮類、木質(zhì)素類、生物堿類、多糖類、有機酸類及微量元素等[1]。近年來，國內(nèi)外對知母的活性成分研究逐漸深入，許多從知母根莖中分離出來的成分具有極大的藥用價值，如皂苷、雙苯吡酮等[3]，但關(guān)于知母根莖中微量金屬元素的研究卻很少。值得注意的是，很多中藥材的寒涼溫熱屬性以及藥效藥性等均與其含有的微量金屬元素有關(guān)[4-5]。

濁點萃取是近年來新興的用來分離富集痕量元素的液-液萃取技術(shù)，具有操作簡單、萃取效率高、富集因子大、不使用有毒有害的有機溶劑等優(yōu)點，是環(huán)境友好型方法。其易于與其他分析技術(shù)聯(lián)用，如紫外可見分光光度法、反相高效液相色譜法、氣相色譜法、質(zhì)譜法及流動注射分析等[6-11]，可實現(xiàn)金屬元素及其他樣品的分離、富集以及測定等，自問世以來便得到廣泛應(yīng)用。知母根莖中的微量元素鐵是人體所必需的十多種微量元素中居于首位的元素，是合成人體血紅蛋白的重要原料之一，也是知母清熱瀉火、生津潤燥的基礎(chǔ)藥效物質(zhì)之一[12-14]。因此，本文運用濁點萃取-紫外分光光度計法結(jié)合濕法消解測定知母中鐵元素含量，為其后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 藥材與試劑

知母產(chǎn)自河北，購自廣州致信藥業(yè)有限公司，由廣東藥科大學中藥學院劉基柱副教授鑒定為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.) 的干燥根莖。無水乙醇、正丁醇、正己醇、正庚醇、正辛醇(分析純，天津市致遠化學試劑廠)；正癸醇(分析純，上海阿拉丁試劑)；Triton X-100(分析純，上海MACKLIN)；硝酸、鹽酸、硫酸、30%過氧化氫(廣州化學試劑廠)。

1.2 儀器

S220 pH計(瑞士Metter Toledo公司)；GH-252 0.01 mg電子天平(日本AND公司)；Fresco17離心機(美國Thermo公司)；DU-800紫外-可見光光度計(美國Beckman Coulter公司)；DB-3不銹鋼電熱板(江蘇金壇市宏華儀器廠)；DL-400A超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)；DFY-500高速中藥粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；移液槍(德國Eppendorf公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 鐵標準溶液制備

精密稱取0.212 20 g硫酸鐵銨，加入10 mL 50%硫酸水溶液，超聲5 min。轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度，搖勻，制成鐵離子儲備液。精密移取10 mL儲備液至100 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度，搖勻，制成鐵離子標準溶液。

濁點萃取標準液中的鐵元素：準確移取鐵標準溶液0.5 mL至15 mL帶刻度離心管中，依次加入2.2 mL 0.5 mol/L KSCN溶液，0.6 mL 5% Triton X-100溶液，0.1 mL 5%硫酸溶液，2.2 mL 正己醇。震蕩，加入去離子水補足至10 mL，于30℃水浴鍋中恒溫反應(yīng)10 min。4 000 rpm下離心5 min，使溶液分相完全，用巴氏吸管小心吸去下層水相，準確加入2.0 mL無水乙醇稀釋剩余有機相，混勻。待測。

2.2 供試品溶液制備

2.2.1 濕法消解知母藥材 用粉碎機粉碎適量知母藥材至細粉末。分別稱取3份知母藥材粉末樣品于錐形瓶中，標記為A、B、C。其中A：1.004 g；B：1.004 g；C：0.998 g。分別加入20 mL濃硝酸過夜預消解，置于電熱板上加熱至不冒黃煙。取下靜置至室溫，加入5 mL過氧化氫溶液，繼續(xù)加熱消解。待剩下少量溶液，再分3次補加共約30 mL過氧化氫溶液。加熱一段時間后，溶液澄清透明無色，加適量水趕酸，繼續(xù)加熱消解至剩下約1 mL溶液，取下靜置至室溫，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度，搖勻，制成A、B、C三組待萃取樣品溶液。

2.2.2 濁點萃取知母消解液中的鐵元素 移取1.5 mL A、B、C待萃取樣品溶液，余下步驟同“2.1”項下方法得A、B、C供試品溶液。

2.3 標準曲線繪制

分別精確吸取經(jīng)過濁點萃取處理的鐵標準液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，相應(yīng)的鐵離子濃度見表1，在波長λ=497 nm下測定吸光度，繪制標準曲線，測定結(jié)果見圖1。鐵離子濃度在1.0～2.8 μg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：A=0.153 5c-0.017 3，r=0.999 2。

表1 標準曲線待測液濃度

圖1 鐵離子濃度與吸光度關(guān)系的標準曲線

2.4 方法學考察

2.4.1 穩(wěn)定性實驗 取同一份供試品樣品，測定鐵含量后，分別在1、2、4、8、12、24 h再次測定吸光度。結(jié)果見圖2。待測樣品室溫放置1 h后，A、B、C三組吸光度僅下降0.1%～0.7%；而室溫放置24 h后A、B兩組樣品吸光度分別下降8.2%、9.8%，但C組24 h吸光度異常上升，有可能是實驗操作問題，數(shù)據(jù)舍去。由此可推斷，樣品在配制到測定完成的30 min左右吸光度下降可以忽略，溶劑穩(wěn)定性強，對結(jié)果影響可忽略。

圖2 供試品樣品不同時間點顯色吸光度

2.4.2 鐵標準溶液顯色穩(wěn)定性 酸對減緩樣品褪色現(xiàn)象有積極作用。本實驗分別測定2組用鐵標準溶液配制的樣品，第1組不加酸，第2組加0.1 mL 5%硫酸，每隔10～15 min測定其吸光度。結(jié)果見圖3。第2組加酸的樣品在40 min時吸光度僅下降2.53%；而第1組不加酸的樣品在20 min時吸光度就下降了6.37%，在40 min時下降了13.43%。由此可推測，在繪制標準曲線時加入適量的酸能有效提高溶液的顯色穩(wěn)定性，實驗要求在40 min內(nèi)完成測定，對結(jié)果無影響。

圖3 鐵標準溶液不同時間點顯色吸光度

2.4.3 加標回收率測定 按照“2.1”項下方法配制100 mg/L的鐵離子標準溶液母液，移取7 mL至100 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度，搖勻，得7 mg/L的鐵標準溶液。分別吸取A、B、C三組經(jīng)濁點萃取的待測樣品溶液0.750 mL，以及相當于當量Fe元素的鐵標準溶液(7 mg/L)，加入離心管中，以空白消解液為參比，在波長λ=497nm下測定各待測樣品溶液的吸光度，每組樣品平行測定2份。所得結(jié)果見表2。測定6次，樣品加標回收率均在95%～105%范圍內(nèi)，加標回收率良好，表明在最佳測定條件下，F(xiàn)e元素能夠充分顯色并被萃取出來；RSD值為2.74%，說明此最佳條件下濁點萃取法的重現(xiàn)性良好。

2.5 最佳檢測波長的選擇

以空白試劑作為參比，在波長400～800 nm范圍內(nèi)對Fe3+-SCN--Triton X-100絡(luò)合物體系進行光譜掃描，以確定體系最佳吸收波長。結(jié)果表明，該體系在497 nm處吸光度最大，因此選擇497 nm波長測定該絡(luò)合物體系。

2.6 紫外分光光度計測定知母消解液中的鐵元素含量

取A、B、C三組供試品溶液，分別加入2 mL離心管中，13 000 rpm離心5 min。精確吸取上清液1.5 mL加入離心管中，以空白消解液為參比，在波長λ=497 nm下測定吸光度，結(jié)果見表3。由表可知，每1 g知母藥材中含有Fe元素170.8 μg，RSD值為3.67%，表明結(jié)果準確可靠。

表2 加標回收率實驗結(jié)果

表3 樣品Fe含量測定結(jié)果

3 討論

濁點萃取雖然運用廣泛，但其作用原理尚不明確，目前普遍認為是當體系溫度時，表面活性劑的膠束尺寸變大，氫鍵的結(jié)合力不足以保持水分子連接在醚的氧原子，隨著溫度的升高，表面活性劑極性基團水化層被破壞，從而導致膠束內(nèi)斥力降低和膠束聚集體劇增，溶液出現(xiàn)渾濁和相分離，該溫度被稱為濁點溫度，由于膠束體積小，所以起到了富集作用[6,15]。

在濁點萃取中，濁點溫度是影響萃取效率以及溶液體系顯色穩(wěn)定性的最重要的參數(shù)之一。影響濁點溫度的因素有很多，本文考察了不同種類的醇(正丁醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正癸醇)及用量(1.0～2.4 mL)對濁點萃取效果的影響，結(jié)果表明2.2 mL正己醇對1.5 mL知母消解液的萃取效果較好。同時對表面活性劑 Triton X-100(0～2.4 mL)和顯色劑KSCN(1.0～2.8 mL)的用量、平衡溫度(25～60℃)與平衡時間(0～40 min)、pH(有無加入5%硫酸)進行了考察，確定了濁點萃取的最佳條件，即1.5 mL知母消解液，2.2 mL 0.5 mol/L KSCN作為顯色劑；0.6 mL 5% Triton X-100作為表面活性劑；2.2 mL正己醇作為有機相；0.1 mL 5%H2SO4調(diào)節(jié)pH=1～2以保持體系穩(wěn)定；體系平衡溫度30 ℃，平衡時間10 min。

4 結(jié)語

本研究借助濕法消解知母藥材，運用濁點萃取法萃取出消解液中的鐵元素并采用紫外分光光度法測定其含量。通過實驗優(yōu)化了濕法消解、濁點萃取及紫外分光光度法的最佳條件，測得知母藥材中鐵元素含量為170.8 μg/g。本實驗建立了基于濕法消解知母藥材結(jié)合濁點萃取-紫外分光光度法，簡單、高效、快速地測定知母藥材中鐵元素含量，對環(huán)境無污染，為知母的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。