張 莉

(山東現(xiàn)代學(xué)院 山東 濟(jì)南 250104)

長(zhǎng)白落葉松(Larixolgensis)，落葉松屬，落葉喬木，分布以長(zhǎng)白山為中心，北至北緯45°20′處的穆棱與雞西樺木林場(chǎng)，南至北緯40°30′的遼寧省寬甸縣，西至東經(jīng)124°30′，東至國(guó)境[1]，其具有生長(zhǎng)快、干形好、適應(yīng)性強(qiáng)及綜合利用價(jià)值高等特點(diǎn)[2]。

長(zhǎng)白落葉松生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，采用常規(guī)育種技術(shù)選育新品種耗時(shí)長(zhǎng)、見(jiàn)效慢，且后代性狀難以定向改良，因此，采用離體組織培養(yǎng)進(jìn)行快繁頗為重要。目前，日本落葉松、華北落葉松及興安落葉松等樹(shù)種已建立了離體快繁體系[3～6]，而關(guān)于長(zhǎng)白落葉松組織培養(yǎng)的研究較少，本研究從外植體消毒方式及愈傷組織與不定芽誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基、激素組合和配比的選取等方面著手，篩選出更加高效的消毒方式及更適宜于愈傷組織與不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基類型及激素組合與配比，旨在為長(zhǎng)白落葉松組織離體培養(yǎng)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用長(zhǎng)白落葉松種子為2016年9月采自于黑龍江省牡丹江市林口縣青山國(guó)家落葉松良種基地落葉松種子園。采集后放入-20℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體處理與消毒

將成熟且飽滿的種子去皮，流水沖洗2 d，用70% 酒精消毒1 min，用4%NaClO分別消毒10 min、15 min、20 min、25 min，剝?nèi)ヅ呷椋瑢⒑献优呓臃N至培養(yǎng)基上，再用0.5%NaClO消毒合子胚2 min(此步驟設(shè)置空白對(duì)照)，吸干胚上水分，接種培養(yǎng)。3 d后，統(tǒng)計(jì)污染率；7 d后，統(tǒng)計(jì)存活率。以上涉及使用試劑的步驟皆用無(wú)菌水洗凈后再處理。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

選取MS、BM及DCR 3種培養(yǎng)基，激素組合及配比為：

MS培養(yǎng)基上：2,4-D(0.5 mg·L-1,1.0 mg·L-1,2.0 mg·L-1)+6-BA(0.05 mg·L-1,0.5 mg·L-1,1.0 mg·L-1)共9種處理，6-BA(0.05 mg·L-1,0.5 mg·L-1)+NAA(0.5 mg·L-1,1.0 mg·L-1,2.0 mg·L-1)共6種處理；

BM培養(yǎng)基上：6-BA(0.1 mg·L-1,1.0 mg·L-1,2.0 mg·L-1)+NAA(0.5 mg·l-1,1.0 mg·l-1,2.0 mg·l-1)共9種處理，TDZ(1.0 mg·L-1,1.5 mg·L-1,2.0 mg·L-1,2.5 mg·L-1)共4種處理；

DCR培養(yǎng)基上：2,4-D(0.5 mg·L-1,1.0 mg·L-1,2.0 mg·L-1)+6-BA(0.5 mg·L-1,1.0 mg·L-1)+KT(0.5 mg·L-1,1.0 mg·L-1)共12種處理。

2,4-D為吲哚乙酸，6-BA為6-芐氨基腺嘌呤，NAA為萘乙酸，TDZ為噻苯隆，KT為激動(dòng)素。以上每個(gè)處理上至少接種30個(gè)合子胚，重復(fù)3次，置于溫度23 ℃～25 ℃，光照培養(yǎng)。28 d后，觀察愈傷組織生長(zhǎng)狀況并統(tǒng)計(jì)愈傷率。

1.2.3 不定芽的誘導(dǎo)

選取1/2MS、MS、1/2BM、BM、1/2DCR、DCR 6種培養(yǎng)基，添加1.5 mg·L-1TDZ，篩選最適培養(yǎng)基；在BM上設(shè)置TDZ(1.0 mg·L-1,1.5 mg·L-1,2.0 mg·L-1)+NAA(0,0.1 mg·L-1,0.5 mg·L-1)共9種處理組合，篩選最佳激素組合。上述每種處理接種30個(gè)外植體(愈傷組織)，重復(fù)3次，培養(yǎng)4周，統(tǒng)計(jì)不定芽的誘導(dǎo)率。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析方法

Rj= 100%*Rs/Js

Ch= 100%*Cs/(Js-Rs)

Yy= 100%*Ys/Js

By= 100%*Bs/Js

式中：Rj為染菌率(%)；Rs為染菌數(shù)(個(gè))；Js為接種外植體數(shù)(個(gè))；Ch為存活率(%)；Cs為存活數(shù)(個(gè))；Yy為愈傷組織誘導(dǎo)率，簡(jiǎn)稱愈傷率(%)；Ys為誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)(個(gè))；By為不定芽誘導(dǎo)率(%)；Bs為誘導(dǎo)出不定芽的外植體數(shù)(個(gè))。

數(shù)據(jù)分析采用T檢驗(yàn)、方差分析及多重比較等方式，使用Excel 2016、Spss17.0及Minitab16.0 等軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。百分率指標(biāo)在進(jìn)行T檢驗(yàn)及方差分析時(shí)進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)化后再分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對(duì)消毒效果的影響

不同消毒處理對(duì)消毒效果的影響具體見(jiàn)圖1。

圖1 不同消毒處理的染菌率及存活率散點(diǎn)折線圖

圖中左側(cè)為染菌率，右側(cè)為存活率，兩者的橫標(biāo)從左至右依次代表8種處理，每種處理都以“4%NaClO消毒去皮種子時(shí)間+0.5%NaClO消毒胚時(shí)間”作為標(biāo)注。

從圖1中可知，染菌率隨消毒去皮種子的時(shí)間的增加而下降，同時(shí)消毒種子和胚的效果比僅消毒種子的效果好，因此，對(duì)外植體消毒時(shí)，不僅要消毒去皮種子，還須消毒胚。存活率隨消毒去皮種子時(shí)間的增加出現(xiàn)了先上升后下降的規(guī)律，只消毒種子時(shí)拐點(diǎn)出現(xiàn)在消毒種子20 min時(shí)，同時(shí)消毒種子和胚時(shí)拐點(diǎn)出現(xiàn)在消毒種子15 min及消毒胚2 min時(shí)，這說(shuō)明消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響外植體活力。結(jié)合染菌率和存活率，最終確定最佳的消毒方式為消毒去皮種子15 min及消毒胚2 min。

2.2 愈傷組織誘導(dǎo)

為研究培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響，對(duì)3種培養(yǎng)基上的愈傷率做了雙樣本T檢驗(yàn)，具體見(jiàn)表1。從表中可以看出，MS與BM上的愈傷率差異顯著，MS與DCR上的愈傷率差異極顯著，BM與DCR上的愈傷率差異極顯著。在3種培養(yǎng)基上愈傷率表現(xiàn)為BM>MS>DCR，因此，BM為愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基，愈傷率達(dá)到近50%。

為研究不同激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，對(duì)不同培養(yǎng)上的激素組合進(jìn)行了雙樣本T檢驗(yàn)，具體結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，MS+2,4-D+6-BA與DCR+2,4-D+6-BA+KT上的愈傷率差異極顯著，與其他組合差異不顯著；MS+6-BA+NAA與BM+6-BA+NAA及BM+TDZ上的愈傷率差異顯著，與DCR+2,4-D+6-BA+KT差異極顯著；BM+6-BA+NAA與BM+TDZ差異不顯著，與DCR+2,4-D+6-BA+KT差異極顯著；BM+TDZ與DCR+2,4-D+6-BA+KT差異極顯著。在5種組合中愈傷率表現(xiàn)為BM+TDZ>BM+6-BA+NAA>MS+2,4-D+6-BA>MS+6-BA+NAA>DCR+2,4-D+6-BA+KT，因此，BM+TDZ為愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基及激素組合，愈傷率達(dá)到65%。

BM+TDZ組合中，胚接種3d，胚的根部變紫紅色，1 w子葉變綠，且子葉及胚軸增粗，形成愈傷組織。3 w～4 w，可觀察到生長(zhǎng)良好的愈傷組織(見(jiàn)圖2)。同時(shí)，愈傷率為BM+TDZ(2.0 mg·L-1)>BM+TDZ(1.5 mg·L-1)>BM+TDZ(1.0 mg·L-1)>BM+TDZ(2.5 mg·L-1)，因此，BM+TDZ(2.0 mg·L-1) 為愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基及激素組合與配比，愈傷率達(dá)到89%。

表1 不同培養(yǎng)基及激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

注：*代表差異顯著，**代表差異極顯著

2.3 不定芽的誘導(dǎo)

不同培養(yǎng)基及激素組合與配比對(duì)不定芽誘導(dǎo)影響的具體結(jié)果見(jiàn)表2。

不同培養(yǎng)基上不定芽誘導(dǎo)率的均值比較結(jié)果為BM>DCR>1/2MS>1/2BM>1/2 DCR>MS，在BM培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率達(dá)到約79%。同時(shí)，經(jīng)過(guò)后續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)BM上的愈傷組織表面出現(xiàn)了綠色顆粒狀芽點(diǎn)(見(jiàn)圖3)，并長(zhǎng)出生長(zhǎng)好的不定芽；在MS上的愈傷組織表面出現(xiàn)了黃綠色凸起的芽原基，但最后變黃并逐漸死亡。不同激素組合及配比中不定芽誘導(dǎo)率的均值比較結(jié)果為TDZ(1.5 mg·L-1)+NAA(0.0 mg·L-1)>TDZ(1.0 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)>TDZ(1.5 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)>TDZ(1.0 mg·L-1)+NAA(0.0 mg·L-1)>TDZ(1.5 mg·L-1)+NAA(0.5 mg·L-1)>TDZ(2.0 mg·L-1)+NAA(0.5 mg·L-1)>TDZ(1.0 mg·L-1)+NAA(0.5 mg·L-1)> TDZ(2.0 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)>TDZ(2.0 mg·L-1)+NAA(0.0 mg·L-1)，在TDZ(1.5 mg·L-1)+NAA(0.0 mg·L-1)處理時(shí)誘導(dǎo)率達(dá)到80%。

為研究不同培養(yǎng)基及激素組合與配比對(duì)不定芽誘導(dǎo)影響的穩(wěn)定性，進(jìn)行了穩(wěn)定性分析，以變差系數(shù)(100%*標(biāo)準(zhǔn)差/平均數(shù))作為衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)，變差系數(shù)越大，說(shuō)明越不穩(wěn)定(見(jiàn)表2)。不同培養(yǎng)基上不定芽誘導(dǎo)率的變差系數(shù)比較結(jié)果為BM<1/2BM<1/2MS

表2 不同培養(yǎng)基及激素組合與配比對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

注：**代表差異極顯著；同列不共享字母間差異極顯著。

圖2 BM+2.0 mg·L-1TDZ誘導(dǎo)的愈傷組織

圖3 BM培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的不定芽

不同處理對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響結(jié)果做了方差分析，旨在檢驗(yàn)不同處理的結(jié)果是否達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著差異水平。由表2可知，不同培養(yǎng)基對(duì)不定芽誘導(dǎo)的效果差異極顯著，其F值為79.08；不同激素組合與配比對(duì)不定芽誘導(dǎo)的效果為：不同濃度的TDZ、不同濃度NAA及TDZ與NAA的交互作用對(duì)不定芽的誘導(dǎo)效果差異極顯著，但從多重比較結(jié)果可以看出，TDZ對(duì)不定芽誘導(dǎo)影響更大。

總之，結(jié)合均值比較、穩(wěn)定分析、方差分析及多重比較得出：BM培養(yǎng)基為不定芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基，TDZ(1.5 mg·l-1) 單獨(dú)處理愈傷組織時(shí)不定芽的誘導(dǎo)效果最好。

3 結(jié)論與討論

外植體的選擇是離體快繁的關(guān)鍵，目前，針葉樹(shù)離體培養(yǎng)大多采用合子胚、子葉、下胚軸及嫩芽等幼嫩組織作外植體[7]。趙健[8]等人利用成熟合子胚為外植體進(jìn)行華北落葉松離體培養(yǎng)取得較好的效果。唐巍[9]等人在研究火炬松時(shí)發(fā)現(xiàn)，成熟合子胚較其他器官離體發(fā)生更有效。本試驗(yàn)采用成熟合子胚為外植體，獲得了較高的愈傷組織及不定芽的誘導(dǎo)率。

外植體無(wú)菌是植物組織培養(yǎng)的前提，因此，對(duì)長(zhǎng)白落葉松成熟種子表面及內(nèi)部消毒滅菌是必不可少的。王偉達(dá)[10]等用1%NaClO消毒去皮種子50 min+0.5%NaClO浸泡胚2 s獲得了最佳的消毒效果。趙健[8]等發(fā)現(xiàn)用75% 酒精消毒3 min種子后，再在0.1%升汞中浸泡10 min為最佳消毒方法。朱曉丹[11]等研究云南松成熟胚離體培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)最佳的消毒效果為先用75%的酒精浸種40 s，再用l%的升汞消毒2 min，重蒸餾水沖洗4～5次。本研究采用70% 酒精消毒去皮種子1 min，再用4%NaClO消毒種子15 min，最后用0.5%NaClO消毒胚2 min，既顯著降低了胚的污染率，又保證了胚的存活率。

有研究表明，培養(yǎng)基中TDZ的濃度能明顯影響愈傷組織誘導(dǎo)率。曹焱[12]等在研究植物激素對(duì)成熟紅松合子胚誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，發(fā)現(xiàn)在LM培養(yǎng)基中添加0.5 mg·L-1TDZ可顯著提高愈傷率，且愈傷率為75.7%。秦靜遠(yuǎn)[13]等以杜鵑葉片為外植體利用TDZ亦成功地誘導(dǎo)出愈傷組織。使用TDZ進(jìn)行月季葉片[14]及葡萄芽切段[15]誘導(dǎo)愈傷組織也獲得了很好的效果。本試驗(yàn)在BM培養(yǎng)基上添加2.0 mg·L-1TDZ，誘導(dǎo)出質(zhì)量?jī)?yōu)良的愈傷組織，BM培養(yǎng)基上添加1.5 mg·L-1TDZ，得到了很高的不定芽誘導(dǎo)率。

本研究以長(zhǎng)白落葉松成熟合子胚為外植體，經(jīng)過(guò)脫分化形成愈傷組織，再分化出不定芽，為長(zhǎng)白落葉松無(wú)性擴(kuò)繁及轉(zhuǎn)基因新品種培育奠定了基礎(chǔ)。