鄭渝川,黃仲華,黃伊嘉,楊 凌,吳 斌

(四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川 成都 610066)

食品抗氧化劑是指延滯因氧化而引起的食品劣變、酸敗或變色的物質(zhì)。合成抗氧化劑如BHT、BHA和TBHQ長(zhǎng)期以來(lái)一直壟斷著食品抗氧化劑的市場(chǎng)。但人工合成的抗氧化劑具有一定的毒性和致癌作用，因此天然抗氧化劑日益受到人們的重視。天然抗氧化劑大部分從植物中提取，以多酚和黃酮類為主?，F(xiàn)已有迷迭香提取物、茶多酚、甘草抗氧化物、竹葉抗氧化物等天然抗氧化劑已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于高脂食品中。天然抗氧化劑除了防止食品氧化，還有利于身體健康，流行病學(xué)表明，人類患慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)與攝入多酚含量豐富的食品數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)[1]，能減少心血管疾病和癌癥的發(fā)病率[2]。因此，以天然抗氧化劑取代合成抗氧化劑是食品抗氧化劑發(fā)展的趨勢(shì)，同時(shí)尋找更廉價(jià)、高效的多酚提取原料也具有極大的意義。

核桃是世界著名的“四大干果”，核桃仁中含有豐富的多酚類物質(zhì)，不僅對(duì)人體起到了積極的抗氧化作用，而且對(duì)核桃仁本身防止氧化也起到了很好的保護(hù)作用[3]。核桃仁本身具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，直接提取多酚較浪費(fèi)，而部分核桃副產(chǎn)物，如核桃青皮、核桃粕、核桃殼等也含有豐富的多酚[4～6]，這部分資源通常當(dāng)做飼料或丟棄，利用價(jià)值較低或得不到利用?，F(xiàn)有報(bào)道僅研究了單一核桃副產(chǎn)物或單一提取試劑對(duì)多酚提取率和抗氧化性的影響，不同提取試劑以及不同核桃副產(chǎn)物的多酚提取率和抗氧化活性的比較還未見報(bào)道，本研究使用水、甲醇和乙醇提取核桃青皮、核桃粕、核桃殼的多酚成分，比較提取率，并對(duì)其醇提物進(jìn)行體外抗氧化試驗(yàn)，明確其抗氧化性能，以期為核桃副產(chǎn)物的加工和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

干核桃青皮 購(gòu)于中藥店，產(chǎn)地安徽，生產(chǎn)日期2017年11月；核桃粕 購(gòu)于甘孜州祥瑞生態(tài)食品開發(fā)有限公司，核桃粕經(jīng)液壓榨油工藝產(chǎn)出，生產(chǎn)日期2018年1月；核桃殼，采集于鹽亭縣金土地農(nóng)林發(fā)展有限公司，生產(chǎn)日期2017年11月。

1.2 試劑

甲醇，乙醇，硫酸亞鐵，過氧化氫，水楊酸，維生素C，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，鄰苯三酚，鐵氰化鉀，三氯乙酸，以上分析純購(gòu)于成都科龍?jiān)噭┯邢薰荆?,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)，購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 儀器

UV-1800分光光度計(jì)，日本島津儀器有限公司；ML204電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；AS3120超聲清洗機(jī)，天津奧特賽恩斯儀器有限公司； HH-2恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士步琦有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 多酚提取液的制備

將干燥的核桃青皮、核桃粕和核桃殼粉碎，過60目分級(jí)篩備用。稱取100 g樣本置于500 mL錐形瓶中，按1∶5的料液比加入水、70 %甲醇、40%甲醇、70 %乙醇、40 %乙醇，在30 ℃條件下浸泡12 h，放入超聲清洗儀，在30 kHz頻率下超聲2h，每30 min震蕩一次，雙層濾紙減壓抽濾。收集殘?jiān)?，按以上步驟反復(fù)提取3次，合并過濾液。過濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮，用蒸餾水復(fù)溶至20 mL，測(cè)定多酚含量。

1.4.2 多酚的提取率

多酚的測(cè)定使用Folin-Ciocalteu比色法[7]。分別吸取1 mL 0.1 mg·mL-1,0.2 mg·mL-1,0.4 mg·mL-1,0.6 mg·mL-1,0.8 mg·mL-1,1mg·mL-1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于離心管中，再吸取1 mL多酚提取液于離心管中，在標(biāo)準(zhǔn)品和試樣離心管中依次加入1.5 mL福林酚試劑，1 mL 0.2 g·mL-1碳酸鈉，定容至10 mL，60℃避光水浴1 h后，在波長(zhǎng)765 nm處測(cè)定吸光度。計(jì)算公式為：多酚提取率(以沒食子酸計(jì)，mg·g-1)=(a1×v1)/(v2×w),a1：樣液中多酚的含量；v1：提取樣液的體積；v2：測(cè)定取樣液的體積；w：核桃副產(chǎn)物稱樣量。

1.4.3 樣本的稀釋

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了樣本稀釋濃度，選擇合理的測(cè)試濃度范圍的依據(jù)是：DPPH自由基、羥自由基和對(duì)超氧陰離子自由基清除率在10～100%之間,還原力樣品OD值在0.1～1之間。將各試驗(yàn)組多酚提取液稀釋至10 μg·mL-1,30 μg·mL-1,50 μg·mL-1,70 μg·mL-1,90 μg·mL-1,110 μg·mL-1測(cè)定DPPH自由基清除能力；稀釋至0.1 mg·mL-1,0.2 mg·mL-1,0.3 mg·mL-1,0.4 mg·mL-1,0.6 mg·mL-1,0.8 mg·mL-1測(cè)定羥自由基清除能力；稀釋至0.1 mg·mL-1,0.2 mg·mL-1,0.4 mg·mL-1,0.6 mg·mL-1,1.2 mg·mL-1,1.8 mg·mL-1測(cè)定超氧陰離子自由基清除能力；稀釋至20 mg·mL-1,40 mg·mL-1,80 mg·mL-1,160 mg·mL-1,320 mg·mL-1,640 mg·mL-1測(cè)定還原力。

1.4.4 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除率的測(cè)定使用延莎等人的方法[8]。用無(wú)水乙醇稀釋多酚提取物配成5種濃度梯度的待測(cè)液，在10 mL試管中分別加入1 mL待測(cè)液，60%乙醇溶液2 mL，100 μmol·L-1的DPPH乙醇溶液4 mL，混勻30 s放在暗處反應(yīng)30 min。用60 %乙醇調(diào)零，測(cè)定在波長(zhǎng)515 nm處的吸光值A(chǔ)1。同時(shí)，測(cè)定待測(cè)液1mL與3 mL60%乙醇混合液在波長(zhǎng)515 nm處的吸光度A0，再測(cè)定4 mL DPPH溶液與3 mL 60%乙醇在515 nm處的吸光度A2。用Vc作為對(duì)照組。計(jì)算公式為：DPPH自由基清除率=[A2-(A1-A0)/ A2] ×100% 。

1.4.5 羥自由基清除能力的測(cè)定

羥自由基清除能力的測(cè)定使用劉榮等人的方法[9]。分別取濃度為1 mmol·L-1的硫酸亞鐵溶液1.0 mL，不同濃度的樣品溶液1.0 mL，1 mmol·L-1的過氧化氫1.0 mL 于具塞試管中，搖勻，靜置10 min，再加入濃度為3 mmol·L-1的水楊酸溶液2.0 mL，搖勻后靜置30 min，于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定吸光度A2；使用上述同樣的步驟，使用蒸餾水替代樣品溶液，測(cè)定吸光度A0，使用蒸餾水替代水楊酸，測(cè)定吸光度A1。以維生素C為對(duì)照組，以蒸餾水調(diào)零。計(jì)算公式為：羥自由基清除能力=[ A0-(A2-A1)]/A0×100%。

1.4.6 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定

超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定使用鄰苯三酚法[8]。取不同濃度的多酚溶液1.0 mL，50 mmol/L Tris-Hcl溶液(pH值=8.0)5.0 mL 于具塞試管中，25 ℃恒溫水浴20 min，取該混合溶液3.0 mL 于比色皿中，加入濃度為3 mmol·L-1的鄰苯三酚溶液1 mL，搖勻，準(zhǔn)確反應(yīng)3 min，測(cè)定其在波長(zhǎng)325 nm 處的吸光度,記錄在1 s,30 s,60 s,90 s,120 s,150 s讀數(shù)。另外，以無(wú)水乙醇代替樣品測(cè)定鄰苯三酚的自氧化程度，VC溶液為對(duì)照。計(jì)算公式為：(A0-A1)/A1×100%。A1表示小米多酚提取物溶液與鄰苯三酚混合液的氧化速率，每30 s的吸光值擬合直線取其斜率，A0表示鄰苯三酚的自身氧化速率，每30s的吸光值擬合直線取其斜率所得。

1.4.7 還原力的測(cè)定

還原力的測(cè)定采用普魯士藍(lán)法[10]。分別取不同濃度樣品溶液1 mL，0.2 mol/L 的磷酸緩沖液(PBS，pH 值6.6)1 mL 和1%鐵氰化鉀溶液1 mL 于具塞試管中，50 ℃水浴保溫20 min，快速冷卻，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液1 mL，混合后以轉(zhuǎn)速 5 000 r·min-1離心10 min。取上部清液1 mL，依次加入蒸餾水1 mL，0.1%三氯化鐵溶液0.2 mL，充分混勻，靜置10 min 后，在波長(zhǎng)700 nm 下測(cè)定其吸光度，以蒸餾水調(diào)零，維生素C作為對(duì)照組。

1.4.8 分析方法

結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 19進(jìn)行單因素方差分析和Duncan差異顯著性分析，p<0.05表示差異顯著，p>0.05表示差異不顯著。使用Origin 2017軟件作圖，對(duì)體外抗氧化數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合，根據(jù)方程計(jì)算IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚提取率

不同提取試劑對(duì)核桃粕、核桃青皮和核桃殼的多酚提取率的影響見表1。核桃青皮多酚提取率最高，其次是核桃粕，核桃殼最低，這與核桃副產(chǎn)物自身的多酚含量呈正相關(guān)。試劑種類和濃度影響多酚的提取率，乙醇的效果優(yōu)于甲醇，水的提取效果最差，40 % 乙醇濃度的提取率優(yōu)于70 %。雖然，有報(bào)道稱，多酚的提取率與試劑的極性呈正相關(guān)，但本試驗(yàn)的結(jié)果沒有呈現(xiàn)上述規(guī)律，極性最大的水提取率最低，極性最低的乙醇提取率最高，這可能是因?yàn)樘崛∥镏卸喾臃N類不同，不同試劑對(duì)不同種類的多酚提取率有差異，從而導(dǎo)致總提取率不同。另一方面，多酚類化合物在植物體內(nèi)通常與蛋白質(zhì)、多糖以氫鍵或疏水鍵形式形成穩(wěn)定的分子復(fù)合物，因此提取試劑不僅要求對(duì)多酚類物質(zhì)有很好的溶解性，而且必須具有氫鍵斷裂的作用，有機(jī)溶液和水的混合溶液最適合多酚物質(zhì)的提取[11]。水的提取率較低，因此不使用多酚水提物進(jìn)行體外抗氧化試驗(yàn)。

表1 不同提取試劑對(duì)核桃副產(chǎn)物多酚提取率的影響 單位(mg·g-1)

注：同一列字母不同表示不同提取試劑對(duì)多酚提取率差異顯著(p<0.05)。

2.2 DPPH自由基

不同提取試劑對(duì)核桃粕、核桃青皮和核桃殼醇提取的DPPH自由基清除率的影響見圖1。WGSM、WGSE、WSM、WSE、WPM、WPE的DPPH自由基清除率的IC50(半數(shù)抑制濃度)分別為：16.41 μg·mL-1,19.91 μg·mL-1,33.42 μg·mL-1,35.80 μg·mL-1,23.31 μg·mL-1,27.22 μg·mL-1。結(jié)果顯示：核桃青皮醇提物對(duì)DPPH自由基的清除效果最好，甲醇提取效果比乙醇好；核桃殼醇提物的DPPH自由基清除效果最差；3種核桃副產(chǎn)物醇提物對(duì)DPPH自由基的清除能力均低于維生素C。DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若受試物能夠清除它，則提示受試物具有清除羥基自由基、烷基自由基或過氧自由基的能力和打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的作用，因此廣泛用于評(píng)價(jià)天然或合成物質(zhì)的抗氧化特性[12,13]。影響DPPH自由基的清除因素很多，例如Scalzo發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸能顯著增加維生素C的DPPH自由基清除效果，而有機(jī)酸自身沒有任何清除作用[14]，而核桃青皮中的有機(jī)酸含量高于核桃粕和核桃殼，這對(duì)DPPH的清除可能產(chǎn)生協(xié)同作用。

圖1 不同濃度多酚提取液對(duì)DPPH自由基的清除能力注：WGSM：核桃青皮甲醇提取物;WGSE：核桃青皮乙醇提取物;WSM：核桃殼甲醇提取物；WSE：核桃殼乙醇提取物;WPM：核桃粕甲醇提取物;WPE：核桃粕乙醇提取物。下同。

2.3 羥自由基清除能力

羥自由基是目前所知活性氧中對(duì)生物體毒性最強(qiáng)、危害最大的自由基，多余的自由基會(huì)引起體內(nèi)蛋白質(zhì)、酶、脂質(zhì)和核酸的氧化損傷，還與衰老、腫瘤、輻射損傷和細(xì)胞吞噬有關(guān)[15]。3種核桃副產(chǎn)物的醇提物對(duì)羥自由基清除能力見圖2。6種多酚醇提物對(duì)羥自由基的清除能力從大到小排序?yàn)椋篧GSM>WGSE>WSE>WSM>WPM>WPE。WGSM、WGSE、WPM、WPE羥自由基清除率的IC50分別為：0.17 mg·mL-1,0.21 mg·mL-1,0.28 mg·mL-1,0.24 mg·mL-1。6種多酚溶液的濃度與羥自由基清除能力呈正比，當(dāng)多酚溶液濃度達(dá)到0.3mg/mL時(shí)，上升趨勢(shì)趨于平緩。當(dāng)測(cè)試液濃度為0.3 mg·mL-1,0.4 mg·mL-1,0.6 mg·mL-1,0.8 mg·mL-1時(shí)，六組試驗(yàn)組差異顯著(p<0.05)，當(dāng)測(cè)試液濃度為0.1 mg·mL-1時(shí)，WGSM、WGSE和WPE的羥自由基清除率顯著高于WSM、WSE和WPM(p<0.05)。在多酚濃度0.1～0.8 mg·mL-1時(shí)，WGSM對(duì)羥自由清除能力強(qiáng)于維生素C；多酚濃度在0.1～0.3 mg·mL-1時(shí)，三種多酚醇提物的羥自由基清除能力高于維生素C，但隨濃度升高，多酚醇提物的清除率趨于平緩，而維生素C呈線性上升。

圖2 不同濃度多酚提取液對(duì)羥自由基的清除能力

圖3 不同濃度多酚提取液對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力

2.4 超氧陰離子自由基清除能力

氧氣在生物體內(nèi)生成氧自由基時(shí)，首先產(chǎn)生超氧陰離子自由基，它不僅自身具有毒性，而且可以經(jīng)過一系列反應(yīng)生成其他氧離子自由基，進(jìn)一步對(duì)生物產(chǎn)生損害作用。3種核桃副產(chǎn)物的甲醇、乙醇多酚提取液對(duì)超氧陰離子自由基清除能力見圖3。WGSM、WGSE、WPM、WPE羥自由基清除率的IC50分別為：0.71 mg·mL-1,0.65 mg·mL-1,1.54 mg·mL-1,1.53 mg·mL-1。對(duì)羥自由基的清除能力從大到小排序?yàn)椋篧GSE>WGSM>WPE>WPM>WSE>WSM。核桃粕甲醇和乙醇提取物的超氧陰離子自由基的清除能力差異不顯著(p>0.05)，核桃青皮、核桃殼的甲醇和乙醇提取液濃度在0.1 mg·mL-1,0.6 mg·mL-1,1.2 mg·mL-1時(shí)，差異顯著(p<0.05)，這種差異一定程度上證明了不同試劑提取多酚對(duì)抗氧化能力有較大影響，另一方面，提取物中多酚種類也是造成抗氧化能力差異的重要原因。

2.5 還原力

還原能力是表示抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標(biāo)，抗氧化劑自身的還原作用能使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的分子而失去活性，抗氧化能力與還原力強(qiáng)弱呈正相關(guān)[16]。3種核桃副產(chǎn)物的甲醇、乙醇多酚提取物的還原力見圖4，當(dāng)醇提物多酚濃度為640 μg·mL-1時(shí)，WGSM的還原力最高(A700 nm=0.93)，WSM還原力最低(A700 nm=0.51)。當(dāng)多酚濃度為40 μg·mL-1,80 μg·mL-1,160 μg·mL-1,640 μg·mL-1時(shí)，不同核桃副產(chǎn)物多酚醇提物還原力差異顯著(p<0.05)，兩種提取試劑對(duì)還原力的影響差異不顯著(p>0.05)。核桃青皮醇提物的還原能力與維生素C差異不顯著(p>0.05)。

圖4 不同濃度多酚提取液對(duì)還原力的影響

3 結(jié)論

不同的多酚提取試劑對(duì)3種核桃副產(chǎn)物的多酚提取有顯著的差異(p<0.05)，40%乙醇為提取劑時(shí)多酚提取率最高，純水的提取率最低。核桃青皮、核桃殼、核桃粕的甲醇、乙醇提取物對(duì)DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基有一定清除能力和還原力，核桃青皮提取物抗氧化能力最強(qiáng)，各抗氧化性能指標(biāo)等同或優(yōu)于維生素C，核桃粕提取物抗氧化能力次之，核桃殼最差。核桃青皮甲醇提取物對(duì)DPPH自由基、羥自由基清除能力和還原能力最好；核桃青皮乙醇溶液對(duì)超氧陰離子自由基清除能力最好。甲醇提取物對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除能力優(yōu)于乙醇提取物，乙醇提取物對(duì)超氧陰離子自由基清除力和還原能力優(yōu)于甲醇提取物。本研究對(duì)核桃副產(chǎn)物的利用以及其抗氧化活性提供了參考，核桃青皮多酚類物質(zhì)含量豐富，提取率最高，其醇提物的抗氧化活性和還原力較維生素C強(qiáng)，是較好的天然抗氧化劑制備原料。