郭 芳,黃 碩,劉 寧,朱 勇,劉昌奎

(西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科學(xué)教研室,西安 710021;*通訊作者,E-mail:guofang@xiyi.edu.cn)

2003年世界口腔健康統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)占口腔惡性腫瘤的90%以上,OSCC的發(fā)病率在26種主要惡性癌癥中位居第8位[1],以手術(shù)為主的綜合治療為目前的一般治療原則,但術(shù)后易導(dǎo)致語言、進食、吞咽等各種口腔功能障礙及顏面部畸形均嚴重威脅著人類的生活質(zhì)量和健康[2]?；蛑委煂τ诎┘毎哂袧撛诘陌邢蛐?miRNA是一種長度為21-25個核苷酸的小型非編碼RNA,能夠識別特定的目標mRNA的3′端UTR的一個或多個位點,并與之結(jié)合,實現(xiàn)對目標基因表達的調(diào)控[3]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA與癌癥的發(fā)生和發(fā)展是密切相關(guān)的[3]。

miR-195在多種實體腫瘤組織中被發(fā)現(xiàn)處于低表達狀態(tài),如結(jié)腸癌[4]、胃癌[5]、肝癌[6]等。但是,miR-195在口腔鱗狀細胞癌中的表達及其相關(guān)作用機制如何呢?本研究采用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-195的靶基因,構(gòu)建pcDNATM6.2-GW-pre-miR-195重組表達質(zhì)粒,通過雙熒光素酶報告基因預(yù)測miR-195對下游靶基因RAF1表達的影響,以及對口腔鱗狀細胞癌生物學(xué)功能的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑

口腔鱗狀細胞癌SCC-4細胞株、pcDNATM6.2-GW、E.coli DH5α、pmirGLO真核載體均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗中心提供。限制性內(nèi)切酶(Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ、SacⅠ和XhoⅠ)、T4DNA連接酶、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit)均購自Takara公司(大連)，質(zhì)粒抽提、凝膠回收試劑盒購自Qiagen公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000、RNA抽提試劑Trizol購自美國Vitrogen公司，RIPA、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司，PVDF膜、蛋白發(fā)光液購自Millipore公司，鼠抗人β-actin購自Santa Cruz公司，RAF1購自Abcam公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司。

1.2 miR-195過表達載體的構(gòu)建與si-RAF1的設(shè)計合成

從miRBase網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫中檢索has-miR-195的pre-miR-195頸環(huán)序列,設(shè)計并合成兩端帶有HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點的互補雙鏈DNA，序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,正義鏈為5′-AATTCAGCTTCCCTGGCTCTAGCAGCACAGAAATAT TGGCACAGGGAAGCGAGTCTGCCAATATTGGCTGTG CTGCTCCAGGCAGGGTGGTGA-3′,反義鏈為5′-AGCTTCACCACCCTGCCTGGAGCAGCACAGCCAATA TTGGCAGACTCGCTTCCCTGTGCCAATATTTCTGTGC TGCTAGAGCCAGGGAAGCTG-3′。將其退火為雙鏈DNA序列,采用T4 DNA連接酶將其與pcDNATM6.2大片段相連構(gòu)建為pre-miR-915過表達載體。si-RAF1兩條鏈分別為:5′-CUCACAGAUCCUUCUAAGATT-3′,5′-UCUUAGAAGGAUCUGUGAGTT-3′,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-195、RAF1的表達量

驗證miR-195、si-RAF1在細胞株中的表達,將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW-pre-miR-195及si-RAF1轉(zhuǎn)染SCC-4細胞,然后qRT-PCR檢查成熟miR-195的表達水平及RAF1被沉默后的表達水平。RAF1的上游引物為:5′-GGGAGCTTGGAAGACGATCAG-3′,下游引物為:5′-ACACGGATAGTGTTGCTTGTC-3′;miR-195的逆轉(zhuǎn)錄引物序列為5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATA CGACGCCAATA-3′,上游引物為:5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′,下游引物為:5′-TGCTTAGCAGCACAGAAA-3′,U6和β-actin分別作為miR-195和RAF1的內(nèi)參。條件：95℃ 1 min預(yù)變性，95 ℃變性10 s，60 ℃退火，延伸40 s，重復(fù)40個循環(huán)，采用2-ΔΔCt計算miR-195、RAF1的表達量。

1.4 MTT檢測SCC-4細胞增殖活性

96孔板每孔約3 000個細胞,采用Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑按說明書進行轉(zhuǎn)染。各組設(shè)3個復(fù)孔,分別于轉(zhuǎn)染后24,48,72 h加入20 μl MTT,37 ℃孵育4 h棄上清，加入150 μl DMSO，于492 nm波長下檢測SCC-4細胞的吸光值。

1.5 克隆形成實驗檢測SCC-4細胞形成能力

根據(jù)不同分組對SCC-4細胞進行轉(zhuǎn)染,24 h時分別按照500個/孔、1 000個/孔、2 000個/孔加入6孔板中。置于5% CO2,37 ℃培養(yǎng)。每隔2 d更換培養(yǎng)基。10-14 d觀察克隆形成的大小,棄去培養(yǎng)基,用PBS輕輕沖洗3次、風(fēng)干。每孔加入0.1%的結(jié)晶紫500 μl,37 ℃,染色30 min,再用PBS沖洗干凈。用凝膠成像儀拍照。

1.6 流式細胞儀檢測SCC-4細胞凋亡

按2×105個/孔將細胞種于12孔板中。24 h觀察細胞狀態(tài)生長良好,融合度達到80%以上,更新培養(yǎng)液1 ml,轉(zhuǎn)染si-RAF1和si-control至SCC-4細胞。待細胞培養(yǎng)48 h,胰酶消化細胞收集于15 ml離心管中,1 000 r/mim離心5 min。吸取棄上清,PBS沖洗細胞3次。棄上清,加400 μl的1×binding buffer,重懸細胞,再加5 μl Annexin Ⅴ-FITC,于4 ℃避光染色15 min。加入10 μl PI染液,避光4 ℃染色5 min,采用流式細胞儀檢測。

1.7 流式細胞儀檢測SCC-4細胞周期

根據(jù)不同分組對SCC-4細胞進行轉(zhuǎn)染，將收集的SCC-4細胞，加入含70%乙醇的PBS(4 ℃預(yù)冷2 h以上)重懸細胞，4 ℃過夜固定。1 000 r/min離心5 min，棄上清液。用PBS沖洗細胞2次，離心棄上清PBS，避光加150 μl RNA酶和150 μl PI，輕柔混合，室溫避光靜置30 min，采用流式細胞儀檢測。

1.8 雙熒光素酶報告基因檢測miR-195對RAF1的靶向作用

采用targetscan(http://www.targetscan.org/)根據(jù)堿基互補配對原則選取miR-195的候選靶基因RAF1，分別于TGTTTTCAGAGAAGCTGCTGCTA及其互補鏈兩側(cè)添加SacⅠ和XhoⅠ雙酶切位點，命名為野生型RAF1(WT-RAF1)，同時在種子區(qū)設(shè)計突變型RAF1(MT-RAF1)，并將其退火為雙鏈DNA，與pmirGLO載體大片段相連構(gòu)建為RAF1野生型及突變型報告載體。收集對數(shù)期的SCC-4細胞，每孔約4×103個細胞鋪于96孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔，分別轉(zhuǎn)染miR-195+pmirGLO，miR-195+WT-RAF1，miR-195+MT-RAF1。根據(jù)Promega公司雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書添加螢火蟲和海腎熒光素酶試劑進行檢測。

1.9 遷移實驗檢測RAF1的遷移能力

將轉(zhuǎn)染的SCC-4細胞5×105/ml置于含1% FBS的DMEM的Transwell上室內(nèi),下室加入含10% FBS的600 μl DMEM,孵育24 h,棉簽擦去上室細胞,倒置風(fēng)干Transwell小室,24孔板中加入500 μl結(jié)晶紫,小室浸于其中,37 ℃孵育30 min，PBS清洗、拍照。

1.10 Western blot檢測RAF1表達

將轉(zhuǎn)染后的SCC-4細胞采用RIPA裂解液按照操作說明提取蛋白，配置10%的SDS-PAGE凝膠，每孔20 μg蛋白量上樣、電泳，室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫下孵育1.5 h，TBST洗膜，化學(xué)發(fā)光觀察蛋白的表達情況。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,組間比較采用t檢驗進行分析,P<0.05時認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建miR-195過表達載體及si-RAF1

將構(gòu)建成功的miR-195過表達載體轉(zhuǎn)染SCC-4細胞,qRT-PCR檢測顯示,轉(zhuǎn)染miR-195組的細胞中miR-195的表達顯著高于miR-control組(見圖1);同時,將合成的si-RAF1轉(zhuǎn)染SCC-4細胞,qRT-PCR檢測顯示轉(zhuǎn)染si-RAF1組細胞中的RAF1的表達顯著低于si-control組(P<0.01,見圖1),上述結(jié)果提示miR-195的過表達載體及si-RAF1均成功合成并且在SCC-4細胞中均具有良好的轉(zhuǎn)染效率。

與相應(yīng)對照組相比,**P<0.01圖1 miR-195和si-RAF1在OSCC細胞中轉(zhuǎn)染效率的驗證Figure 1 Verification of transfection efficiency of miR-195 and si-RAF1 in oral squamous cell carcinoma

2.2 miR-195、si-RAF1抑制SCC-4細胞的生長

分別將miR-195過表達載體、si-RAF1及相應(yīng)control轉(zhuǎn)染SCC-4細胞,MTT法、細胞克隆及流式細胞儀檢測miR-195及si-RAF1對OSCC細胞生長的影響。與對照組相比,miR-195過表達能夠顯著抑制SCC-4細胞的增殖活性、克隆形成能力及誘導(dǎo)細胞周期發(fā)生阻滯(P<0.05，見圖2),同時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染si-RAF1的SCC-4細胞,其增殖活性、克隆形成能力也要明顯低于si-control組,并且顯著誘導(dǎo)細胞周期發(fā)生阻滯(P<0.05,見圖2),上述結(jié)果提示miR-195過表達與RAF1的表達下調(diào)對SCC-4細胞均可發(fā)揮抑癌效應(yīng),抑制OSCC細胞的生長。

2.3 miR-195與si-RAF1能夠促進SCC-4細胞凋亡

miR-195與si-RAF1分別轉(zhuǎn)染SCC-4細胞,流式細胞儀檢測表明,與對照組相比,miR-195的過表達及RAF1的表達下調(diào)均可促進SCC-4細胞早期凋亡和晚期凋亡的發(fā)生(P<0.05,見圖3),從而提示miR-195與si-RAF1具有促進OSCC凋亡發(fā)生的效應(yīng)。

2.4 miR-195和si-RAF1能夠降低SCC-4細胞的遷移能力

將miR-195過表達載體及si-RAF1轉(zhuǎn)染SCC-4細胞后采用Transwell實驗法檢測各組細胞的遷移能力。如圖4所示,與miR-control組相比,miR-195過表達組細胞的遷移率明顯降低;同樣,與si-control組相比,si-RAF1組細胞的遷移率也明顯降低,提示miR-195過表達及RAF1的表達下調(diào)均可抑制OSCC細胞的遷移能力。

A.細胞增殖活性檢測 B.克隆形成能力 C.細胞周期分布變化與對照組相比,*P<0.05，**P<0.01圖2 miR-195與si-RAF1異常表達對SCC-4細胞增殖活性、克隆形成能力及細胞周期的調(diào)控Figure 2 Effect of abnormal expression of miR-195 and si-RAF1 on proliferation activity, clone formation ability and cell cycle of SCC-4 cells

與相應(yīng)對照組相比,*P<0.05，**P<0.01圖3 miR-195與si-RAF1對SCC-4細胞凋亡的調(diào)控Figure 3 Regulation of miR-195 and SI-RAF1 to apoptosis of SCC-4 cells by flow cytometry

2.5 miR-195能夠靶向下調(diào)RAF1的表達

分別對SCC-4細胞共轉(zhuǎn)染miR-195+WT-RAF1、miR-195+MT-RAF1,采用雙熒光素酶報告基因檢測，結(jié)果顯示,與對照組相比,miR-195過表達能夠顯著抑制WT-RAF1報告載體的熒光活性(P<0.05),而miR-195過表達對MT-RAF1的熒光活性無顯著抑制效應(yīng)(見圖5A)。此外,qRT-PCR檢測顯示,miR-195過表達能夠顯著抑制RAF1的mRNA的表達(P<0.01,見圖5B)。Western blot檢測顯示miR-195過表達能夠顯著抑制RAF1蛋白的表達(見圖5C)。由此提示miR-195在OSCC細胞中與RAF1之間存在良好的靶向關(guān)系,能夠靶向下調(diào)RAF1的表達。

3 討論

目前有研究顯示miR-195的異常表達能夠參與人類惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展,但是在不同腫瘤中miR-195的表達卻存在差異,同時miR-195可能涉及的相關(guān)信號通路也不盡相同。在膀胱癌中,miR-195的表達顯著降低,其通過抑制膀胱癌細胞G1/S期轉(zhuǎn)換而抑制膀胱癌生長[7],提示其在膀胱癌中扮演著抑癌的角色。同樣,Li等[8]學(xué)者也在宮頸癌中發(fā)現(xiàn)miR-195的表達顯著降低,并且可以通過靶向細胞周期蛋白D1的表達調(diào)控宮頸癌細胞的侵襲和致瘤性。此外,在結(jié)腸癌中也發(fā)現(xiàn)了miR-195的表達出現(xiàn)顯著下調(diào),過表達的miR-195與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后較差相關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示miR-195過表達組的SCC-4細胞增殖活性顯著低于空載體組;凋亡率高于空載體組;G1期的細胞百分比顯著增高,S/G2期顯著降低;細胞遷移率明顯降低。結(jié)果表明miR-195能夠抑制SCC-4細胞的增殖,促進SCC-4細胞的凋亡,誘導(dǎo)細胞周期G1/S的阻滯,降低SCC-4細胞的遷移。

圖4 miR-195與si-RAF1對OSCC細胞遷移能力的調(diào)控Figure 4 Regulation of miR-195 and si-RAF1 to migration ability of OSCC cells by Transwell

與control比較,*P<0.05 與miR-control比較，**P<0.01 A.雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果 B. qRT-PCR檢測結(jié)果 C. Western blot檢測結(jié)果圖5 miR-195與RAF1靶向關(guān)系的研究Figure 5 Study on the relationship between miR-195 and RAF1

RAF1為一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,是Ras/Raf/MEK/Erk信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的成員。RAF1與多種細胞包括腫瘤細胞和上皮細胞的增殖、存活和遷移密切相關(guān)[10]。在上皮細胞中,血管內(nèi)皮生長因子和堿性成纖維生長因子受體活化的信號傳導(dǎo)都通過下游的RAF1,其可被看作是幾種生長因子誘導(dǎo)腫瘤血管生成的信號樞紐[11];阻斷RAF1可能同時抑制腫瘤細胞的生存和血管形成[12],因此RAF1很有希望成為腫瘤靶向治療的一個新靶點。如在Hood等[11]的試驗和Culmsee等[13]的試驗都是以RAF1為靶點,阻斷了RAF1信號傳導(dǎo),從而抑制腫瘤及腫瘤血管生成。Liu等[14]發(fā)現(xiàn)RAF1在膠質(zhì)母細胞瘤中顯著增高,原因與miR-7-5p的表達降低相關(guān),miR-7-5p作為腫瘤抑制基因通過靶向RAF1癌基因來調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細胞瘤微血管內(nèi)皮細胞的增殖。本研究結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染si-RAF1的SCC-4細胞的增殖活性明顯低于空載體組;凋亡率高于空載體組;G1期的細胞百分比顯著增高,S/G2期顯著降低;細胞遷移率明顯降低。沉默RAF1能夠抑制口腔鱗狀細胞癌SCC-4細胞的增殖,促進SCC-4細胞的凋亡,誘導(dǎo)細胞周期G1/S的阻滯,降低口腔鱗狀細胞癌SCC-4細胞的遷移,其作用結(jié)果與過表達miR-195相一致,那么二者之間是否存在相互的調(diào)控關(guān)系呢?

生物信息學(xué)軟件是預(yù)測miRNAs靶基因重要方法之一。本研究通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測miR-195可能作用的靶基因,結(jié)果顯示,miR-195與RAF1之間存在良好的堿基互補關(guān)系,提示RAF1可能是miR-195的候選靶基因。為了驗證該假說,本研究采用雙熒光素酶報告基因檢測顯示miR-195過表達能明顯抑制野生型RAF1報告載體的熒光活性,同時結(jié)合Western blot和qRT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)miR-195過表達能夠顯著抑制RAF1的mRNA和蛋白的表達,從而進一步證實了本研究的假說:miR-195與RAF1之間存在良好的靶向關(guān)系。

綜上所述,在OSCC中,miR-195的過表達及RAF1的表達下調(diào)可以顯著抑制SCC-4細胞的增殖活性,促進SCC-4細胞的凋亡,誘導(dǎo)細胞周期G1/S的阻滯,降低SCC-4細胞的遷移能力;同時可以靶向下調(diào)RAF1的mRNA和蛋白表達。因此,miR-195可能通過靶向RAF1引起OSCC細胞的生長及遷移能力,并且誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生,可作為OSCC細胞靶向治療的一個潛在靶點,這也為課題后期進一步的機制研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。