李利萍，賴勁東，黃艷，林新瑜

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 皮膚科，四川 瀘州 646000；2.遂寧市第一人民醫(yī)院 皮膚科，四川 遂寧 629000）

黑色素瘤是常見性皮膚惡性腫瘤，世界范圍內(nèi)男性第5大惡性腫瘤，女性第6大惡性腫瘤，且近年來發(fā)病率逐年升高[1]。黑色素瘤早期癥狀隱匿導(dǎo)致其早期診斷率低，一旦確診多屬于晚期，導(dǎo)致黑色素瘤死亡率持續(xù)偏高[2]，目前黑色素瘤的治療主要以手術(shù)切除為主，輔助放療及化療[3]。最新研究發(fā)現(xiàn)中藥在腫瘤治療中起到重要作用，如丹參、川芎或姜黃素等，研究中藥對(duì)黑色素瘤治療對(duì)提高腫瘤預(yù)后提供新的思路。

生姜在亞洲國(guó)家中被廣泛食用，6-姜辣素是生姜提取物中的主要活性成分，其在抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤、抗炎等方面發(fā)揮重要功能[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)6-姜辣素通過促進(jìn)前列腺癌[5]、腎癌[6]和宮頸癌[7]等細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗癌效果，然而6-姜辣素對(duì)黑色素瘤增殖和凋亡的影響尚未報(bào)道。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，各種生理或病理?xiàng)l件下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress,ERs），長(zhǎng)期過強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[8]。本研究旨在探究6-姜辣素對(duì)黑色素瘤增殖和凋亡的影響，探究其是否通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮抗腫瘤功能的分子機(jī)制，為腫瘤治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人黑色素瘤細(xì)胞系M14和A375購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，RPMI 1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，6-姜辣素購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，Annexin V-FITC/碘化丙啶雙標(biāo)記細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于廣州達(dá)博生物科技有限公司，半胱天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）/活化型半胱天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved-Caspase-3）和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 [poly（ADP-ribose） polymerase,PARP]/活化型多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[cleaved-poly（ADP-ribose）polymerase,Cleaved-PARP]抗體購(gòu)自美國(guó) CST 公司，免疫球蛋白結(jié)合蛋白（binding immunoglobulin protein,BIP）、肌醇激酶 1（inositol-requiring enzyme-1,IRE1）和氨基末端激酶（jun N-terminal kinase,JNK）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，β-actin抗體購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及shRNA轉(zhuǎn)染

黑色素瘤細(xì)胞使用含10%胎牛血清RMPI 1640或DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)加入100 μg/ml青霉素（Sigma,USA）和鏈霉素（Sigma,USA），置于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱，每隔2～3天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液，細(xì)胞貼壁達(dá)到80%時(shí)使用0.25%胰酶消化離心進(jìn)行傳代。M14和A375細(xì)胞接種于6孔板中待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%，轉(zhuǎn)染前用PBS清洗細(xì)胞，按轉(zhuǎn)染試劑說明書將無(wú)血清培養(yǎng)基、shRNA基因敲減質(zhì)?；?qū)φ战MControl shRNA及轉(zhuǎn)染試劑混合靜置15 min后轉(zhuǎn)染M14細(xì)胞24或48 h，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.3 甲基噻唑基四唑法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的黑色素瘤細(xì)胞系M14和A375，按5 000個(gè)/孔接種于96孔板，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后加入不同濃度（0、10、20、40、60和80 μmol/L）6-姜辣素進(jìn)行藥物處理，每種濃度藥物設(shè)5個(gè)復(fù)孔，重新放置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h。吸去上清液加入含10%甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）的培養(yǎng)基 200μl繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸去上清液，每孔加入150 μl DMSO并置于微量振蕩器振蕩10 min，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm處檢測(cè)吸光度（A）值，做出細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

M14和A375細(xì)胞接種于6孔板，調(diào)整細(xì)胞密度接種10×104個(gè)/孔培養(yǎng)至貼壁，加入60和40 μmol/L的6-姜辣素分別處理M14和A375細(xì)胞24 h，胰酶消化離心并收集細(xì)胞，使用800 r/min離心5 min并用PBS清洗2次，加入250 μl結(jié)合緩沖液并通過細(xì)胞計(jì)數(shù)獲得細(xì)胞濃度，并調(diào)整濃度為1×106個(gè)/ml，吸取100 μl調(diào)整濃度后細(xì)胞懸液加入5 ml流式管內(nèi)，分別加入 5 μl Annexin V-FITC（150 mg/L）和 10 μl碘化丙錠（120 mg/L）并充分混勻，放置于室溫條件下進(jìn)行避光孵育15 min，孵育后的懸液中加入PBS清洗細(xì)胞，洗滌后的細(xì)胞使用流式細(xì)胞儀（FACS）分析細(xì)胞凋亡率。

1.5 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

M14和A375細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，使用胰酶消化離心并傳代接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至60%～70%時(shí)加入不同濃度6-姜辣素進(jìn)行處理24 h，取出并用PBS清洗3遍，加入細(xì)胞裂解液提取蛋白，4℃、15 000 r/min 離心 15 min，取 5 μl上清液使用 BCA 法測(cè)定蛋白濃度，其余加入6×Loading buffer（1∶5體積比）后在沸水中煮沸5 min變性。取30 μg所提蛋白使用SDS-PAGE凝膠進(jìn)行分離和轉(zhuǎn)膜，PVDF膜使用5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，加入目的抗體置于4℃冰箱的搖床上過夜孵育。TBST洗膜液洗膜10 min×3次，加入二抗置于常溫?fù)u床進(jìn)行孵育1 h。TBST洗膜液洗膜10 min×3次，使用ECL顯影液進(jìn)行顯影。目的蛋白表達(dá)量通過與內(nèi)參蛋白β-actin標(biāo)準(zhǔn)化后得到相對(duì)比值。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)相關(guān)mRNA表達(dá)

M14和A375細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，使用胰酶消化并傳代細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至60%～70%時(shí)使用飛捷RNAfast 200提取RNA，方法參照試劑說明書進(jìn)行操作。使用TaKaRa Prime ScriptTMRT Master Mix RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得 cDNA 模板，逆轉(zhuǎn)錄體系參照試劑說明書。使用TaKaRa SYBR ?Primix Ex TaqTMⅡ反應(yīng)體系檢測(cè) mRNA 表達(dá)檢測(cè)。引物序列：IRE1，正向5'-CACAGTGACGCTTCCTGAA AC-3'，反向5'-GCCATCATTAGGATCTGGGAGA-3'。應(yīng)用β-actin作為內(nèi)參，正向5'-CATGTACGTTGCTA TCCAGGC-3'，反向 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。mRNA的表達(dá)水平采用2-△△Ct計(jì)算方法進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差分析的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；兩組比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6-姜辣素抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖能力

體外使用不同濃度6-姜辣素處理M14和A375細(xì)胞，不同濃度組間細(xì)胞存活率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與對(duì)照組比較，6-姜辣素抑制M14和A375細(xì)胞增殖且呈濃度依賴性，測(cè)得對(duì)M14和A375細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為46.070和33.152μmol/L，根據(jù)IC50濃度選擇分別選擇40/60和20/40μmol/L濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見附表。

附表 黑色素瘤M14和A375細(xì)胞存活率比較 （%，±s）

附表 黑色素瘤M14和A375細(xì)胞存活率比較 （%，±s）

注：?與對(duì)照組比較，P＜0.05

細(xì)胞 0μmol/L 10μmol/L 20μmol/L 40μmol/L 60μmol/L 80μmol/L F 值 P值M14 細(xì)胞 100.000±11.528 93.367±10.382 75.263±4.516? 60.085±14.284? 42.286±8.183? 20.000±12.415? 43.970 0.000 A375細(xì)胞 100.000±4.855 86.752±5.931 60.349±6.584? 40.174±4.85? 31.671±9.745? 20.000±6.854? 102.610 0.000

2.2 6-姜辣素對(duì)黑色素瘤細(xì)胞凋亡的影響

與0μmol/L組比較，6-姜辣素上調(diào)M14細(xì)胞（見圖1A）和A375細(xì)胞（見圖1B）Cleaved-Caspase-3和Cleaved-PARP蛋白水平。

6-姜辣素60μmol/L處理M14細(xì)胞24h后細(xì)胞凋亡率為（28.88±2.24）%（早期+晚期凋亡率）（見圖2A、2B），與 0μmol/L組凋亡率（6.72±1.27）%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=38.504，P =0.000）。6-姜辣素40μmol/L處理A375細(xì)胞24h，細(xì)胞凋亡率為（34.01±3.17）%（早期+晚期凋亡率）（見圖2C、2D），與0μmol/L組凋亡率（7.97±1.69）%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=32.417，P =0.000）。

2.3 6-姜辣素對(duì)黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

M14（見圖3A）和A375（見圖3B）細(xì)胞BIP、IRE1和JNK蛋白表達(dá)上調(diào)。

2.4 6-姜辣素對(duì)IRE1/JNK信號(hào)通路的影響

Western blotting（見圖4A） 和 qRT-PCR（ 見圖4B）結(jié)果顯示IRE1被基因敲減。6-姜辣素處理IRE1基因敲減細(xì)胞，MTT結(jié)果表明IRE1基因敲減后6-姜辣素抑制增殖能力減弱（見圖4C），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.133，P =0.039）；Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，IRE1基因敲減后合用6-姜辣素Cleaved-Caspase-3表達(dá)減少（見圖4D）。

圖1 6-姜辣素對(duì)凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3和Cleaved-PARP表達(dá)的影響

圖2 6-姜辣素對(duì)黑色素瘤細(xì)胞凋亡的影響

圖3 6-姜辣素對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白BIP、IRE1和JNK表達(dá)的影響

圖4 6-姜辣素對(duì)IRE1/JNK信號(hào)通路的影響

3 討論

惡性黑色素瘤在臨床較為常見的皮膚黏膜和色素膜惡性腫瘤，具有進(jìn)展快、預(yù)后差和病死率高等特點(diǎn)，黑色素瘤對(duì)放療和化療不敏感，導(dǎo)致其治療效果不佳。因此選擇有效性治療惡性黑色素瘤的藥物對(duì)于提高其預(yù)后顯得尤為關(guān)鍵。

6-姜辣素是從生姜中提取的最具生物活性部分，既往文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)6-姜辣素抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移[9]，此外其在腎癌、前列腺癌和宮頸癌等疾病中通過促進(jìn)凋亡發(fā)揮抗癌效果。本研究發(fā)現(xiàn)它能抑制黑色素瘤增殖，并呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)6-姜辣素上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Cleaved-Caspase-3和Cleaved-PARP蛋白表達(dá)水平，表明其促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中使用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)6-姜辣素對(duì)凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum,ER）作為細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器主要介導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成、折疊、成熟與分泌。多種生理或病理?xiàng)l件如蛋白質(zhì)糖基化的抑制、缺氧、饑餓、鈣離子流失等會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)聚集，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損而不能發(fā)揮正常生理功能，該現(xiàn)象被稱為ERs[10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為恢復(fù)細(xì)胞正常功能，會(huì)通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response,UPR）來保護(hù)細(xì)胞免受 ERs所引起的損傷。UPR是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78（glucose-regulated protein 78,GRP78）/BIP以及3個(gè)應(yīng)激感受蛋白來介導(dǎo)[11]。當(dāng)ERs不存在時(shí)，3個(gè)應(yīng)激感受蛋白會(huì)與分子伴侶GRP78/BIP結(jié)合處于失活狀態(tài)；當(dāng)ERs存在時(shí)，分子伴侶GRP78/BIP與3個(gè)應(yīng)激感受蛋白解離從而啟動(dòng)UPR反應(yīng)保護(hù)細(xì)胞正常功能。IRE1是介導(dǎo)ERs信號(hào)通路的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白之一，當(dāng)ERs長(zhǎng)期存在不能緩解時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12]，其中IRE1會(huì)通過激活下游JNK信號(hào)通路引起細(xì)胞凋亡[8]。本研究中顯示，6-姜辣素處理后細(xì)胞BIP、IRE1和JNK蛋白表達(dá)水平上調(diào)，表明6-姜辣素引起黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。并發(fā)現(xiàn)IRE1基因高敲減后6-姜辣素的促凋亡作用減弱，驗(yàn)證6-姜辣素可通過IRE1/JNK信號(hào)通路發(fā)揮功能。

綜上所述，6-姜辣素抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡發(fā)生，激活I(lǐng)RE1/JNK內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路是其可能的分子機(jī)制，進(jìn)一步深入探討6-姜辣素治療黑色素瘤的分子機(jī)制，將有可能為黑色素瘤的綜合治療帶來新的選擇。