陳夢霞，汪 妮，孟凡強，周立邦，陳曉宇，趙洪源，唐 超，陸兆新

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇南京 210095）

胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）是指由于各種原因機(jī)體代償性地分泌過多的胰島素而導(dǎo)致葡萄糖的利用率下降[1]。肝臟是胰島素作用的重要靶器官之一，對控制葡萄糖穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用[2]。當(dāng)其產(chǎn)生胰島素抵抗時，組織中活性氧濃度大量增加，造成氧化應(yīng)激反應(yīng)[3]。此外，胰島素介導(dǎo)的PI3K/AKT途徑與肝臟糖代謝和胰島素抵抗密切相關(guān)[4]。胰島素抵抗是造成糖尿病的主要原因之一[5]。糖尿病的危害不僅在于高血糖，它還會造成各種糖尿病并發(fā)癥[4]，并對器官和組織造成進(jìn)一步的損害[2,4,5]。目前，治療糖尿病的方式主要以口服阿卡波糖等藥物及注射胰島素為主，降糖藥的使用容易產(chǎn)生低血糖的副作用且會加重肝臟的負(fù)擔(dān)。因此，尋找一種相對安全的成分來預(yù)防胰島素抵抗的發(fā)生是十分有意義的。

生姜（Zingiber officinaleRoscoe）是一種姜科植物，其原產(chǎn)地為東南亞。生姜根莖在中國、韓國和澳大利亞等許多國家被廣泛用作香料和調(diào)味品[6]。生姜中的主要成分為姜精油[7]、姜辣素[8]以及二苯基庚烷類化合物[9]。姜辣素是生姜中不易揮發(fā)的物質(zhì)，主要包括6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚等[10]。關(guān)于姜辣素與胰島素抵抗的報道主要集中在生姜粗提物、6-姜酚和6-姜烯酚，生姜粗提物中姜辣素含量不明。Fajrin等[11]發(fā)現(xiàn)生姜96%乙醇提取物能緩解糖尿病性神經(jīng)病變。有研究顯示[12]，6-姜酚可通過氧化應(yīng)激途徑緩解由亞砷酸鈉引起的胰島素抵抗，其與高脂飲食引發(fā)的胰島素抵抗發(fā)病機(jī)制不同。6-姜烯酚能夠通過抗炎和抗氧化作用改善糖尿病腎病[13]。但目前，有關(guān)生姜姜辣素是否具有預(yù)防肝臟中胰島素抵抗的作用還未知。

本研究通過提取富含6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的生姜姜辣素來研究其預(yù)防HepG2細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗的作用，為生姜姜辣素作為一種潛在的預(yù)防糖尿病的藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生姜 山東濰坊農(nóng)貿(mào)市場；無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；香草醛、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、DPPH、ABTS、牛胰島素 上海源葉生物科技有限公司；HepG2細(xì)胞 中國科學(xué)院（上海）細(xì)胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)基

美國Gibco公司；葡萄糖氧化酶法測定試劑盒 北京普利萊基因技術(shù)有限公司；BCA試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司；SOD、CAT試劑盒 南京建成生物工程研究所；TransZol up plus RNA Kit試劑盒北京全式金生物技術(shù)有限公司；HiScript? II Q RT SuperMix for qPCR試劑盒 南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

RE 52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；WFJ7200可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；DIONEX3000高效液相色譜儀 美國DIONEX公司；InfiniteF200多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；Series water jacke細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；Centrifuge 5804R冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生姜姜辣素的提取工藝 生姜預(yù)處理：將生姜洗凈切片曬干，用高速粉碎機(jī)磨成粉，過80目篩后，放于4 ℃冰箱密封備用。取密封保存的生姜粉0.5 g，按料液比1:30 g/mL加入80%的乙醇，在40 ℃下水浴振蕩提取1 h后，離心取上清，測定上清液的體積及姜辣素含量，計算姜辣素得率。

1.2.2 單因素實驗 改變料液比1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL、提取時間20、40、60、80、100 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、70%、80%、90%、100%和提取溫度 20、30、40、50、60 ℃來研究各提取因素對姜辣素得率的影響。

1.2.3 正交試驗 根據(jù)以上單因素實驗結(jié)果，選取四個因素的四個水平，依據(jù)L16（45）正交試驗表，設(shè)計正交試驗，根據(jù)正交試驗結(jié)果，確定最佳提取條件，正交試驗因素水平表見表1。

表1 姜辣素提取正交試驗因素水平設(shè)計Table 1 Factors and levels of orthogonal test of gingerols'extraction

1.2.4 姜辣素含量測定 姜辣素含量測定：參考張明昶等[14]的測定方法，因香草醛與姜辣素結(jié)構(gòu)相似，選用香草醛做標(biāo)準(zhǔn)品。香草醛標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：以90%乙醇作溶劑，配制濃度為 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 μg·mL-1的香草醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定采用分光光度計，以90%乙醇調(diào)零，波長為280 nm，求得回歸方程為：y=0.0709x-0.0053，R2=0.9999。樣品溶液同樣以90%乙醇溶液調(diào)零，在280 nm處測定吸光度，代入方程即可計算出相應(yīng)濃度，并測定提取液的體積，可得姜辣素得率。

姜辣素得率（%）=cV/m

式中：c為代入方程得到的相應(yīng)濃度；V為提取液體積；m為生姜粉質(zhì)量。

1.2.5 姜辣素的檢測條件 姜辣素中主要成分6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的高效液相色譜條件[15]：色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈:甲醇:水（40:5:55）；檢測波長為280 nm；體積流量為 1.0 mL·min-1；柱溫 25 ℃；進(jìn)樣量 10 μL。

1.2.6 姜辣素的萃取 將按照正交試驗提取的姜辣素提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇后，加入同等體積的乙酸乙酯[16]萃取3次，合并萃取液旋蒸除去乙酸乙酯，得到深棕色粘稠狀物質(zhì)。將上述粘稠狀物質(zhì)溶于70%乙醇，再加入同等體積的石油醚，置于-20 ℃12 h后取出，得下層深色油狀物，減壓濃縮后制得姜辣素成品[17]。準(zhǔn)確稱取10 mg的姜辣素，加入10 mL的蒸餾水渦旋混勻后，制成1 mg/mL的姜辣素溶液，再根據(jù)需要稀釋至所需濃度，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.7 姜辣素抗氧化活性研究

1.2.7.1 DPPH自由基清除率的測定 參照An等[18]的方法略作修改。取200 μL 0.4 mmol·L-1的DPPH溶液，加入 20 μL 不同濃度（0.4、0.6、0.8 mg·mL-1）的姜辣素樣品溶液，空白組為無水乙醇+DPPH，本底對照為姜辣素溶液+無水乙醇，室溫避光反應(yīng)30 min，517 nm測定吸光度。采用VC作陽性對照，VC濃度為 0.1、0.2、0.4 mg·mL-1，姜辣素對 DPPH 自由基的清除率的計算公式為：

式中：A0為空白對照；A1為本底對照；A2為姜辣素與DPPH。

1.2.7.2 ABTS+自由基清除率的測定 參照An等[19]的方法略作修改。將7 mmol·L-1的 ABTS+和2.45 mmol·L-1的過硫酸鉀按 1:1（v/v）的比例混合，靜置12 h后用PBS稀釋，使混合液在734 nm處的吸光度為 0.70±0.02，取 200 μL 稀釋后的溶液，加入 20 μL不同濃度（0.08、0.1、0.2 mg·mL-1）的姜辣素溶液，空白組為無水乙醇+ABTS，本底對照為姜辣素溶液+PBS，反應(yīng)10 min，734 nm測定吸光值，按照下式計算清除率。同時采用VC作為對照，VC溶液濃度為 0.04、0.06、0.08 mg·mL-1，姜辣素對 ABTS+自由基的清除率的計算公式為：

式中：A0為空白對照；A1為本底對照；A2為姜辣素與ABTS。

1.2.8 HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立 取對數(shù)期的HepG2細(xì)胞消化計數(shù)，使細(xì)胞濃度為6×104個/mL，96孔板每孔加100 μL，邊加邊輕輕搖動細(xì)胞，防止細(xì)胞沉淀。實驗分組為：空白組（不加細(xì)胞）、正常組（不加胰島素）、模型組（加入 0.2、1、5、25 μg·mL-1濃度的胰島素）。待孔底細(xì)胞生長至80%左右時，吸棄舊培養(yǎng)液，用PBS清洗1～2遍，按照以上分組加入含不同濃度胰島素的培養(yǎng)基，邊緣孔加入無菌PBS，分別培養(yǎng)24、48和72 h[20]。

培養(yǎng)結(jié)束后，利用葡萄糖氧化酶法測定試劑盒[21]測定葡萄糖含量，計算葡萄糖消耗量（空白孔含量25 mmol·L-1-測定孔含量）。另外，培養(yǎng)過程中細(xì)胞數(shù)目發(fā)生了變化，需測定細(xì)胞活力計算實際葡萄糖消耗量（實際葡萄糖消耗量=測定葡萄糖消耗量/細(xì)胞活力）。

細(xì)胞活力的測定采用MTT法[22]。具體的方法為：吸棄上清液，每孔加入 100 μL 0.5 mg·mL-1的 MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后小心（避免吸走甲瓚結(jié)晶）將上清吸棄，加入150 μL DMSO，待結(jié)晶物充分溶解，于490 nm測定吸光值，計算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力（%）=（實驗組-空白組）/（正常組-空白組）。

1.2.9 不同濃度姜辣素對HepG2細(xì)胞活力的影響細(xì)胞接種方法同1.2.8，實驗分組為：空白組（不加細(xì)胞）、正常組（不加胰島素）、姜辣素組（6.25、12.5、25、50、100 μg·mL-1）。待孔底細(xì)胞生長至 80% 左右時，吸棄舊培養(yǎng)液，用PBS清洗1～2遍，按分組加入含不同濃度姜辣素的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，采用MTT法檢測細(xì)胞的活力大小，MTT方法同1.2.8。

1.2.10 姜辣素對IR-HepG2細(xì)胞糖代謝的影響 取對數(shù)期的HepG2細(xì)胞，消化計數(shù)，使細(xì)胞濃度為2×106個/mL，6孔板每孔加2.5 mL，邊加邊輕輕搖動細(xì)胞，防止細(xì)胞沉淀。實驗分組為：空白組（不加細(xì)胞）、正常組（不加胰島素）、模型組（只加胰島素，濃度為25 μg/mL）、姜辣素高、中、低劑量組（胰島素與姜辣素混合添加，胰島素濃度為25 μg·mL-1，姜辣素濃度分別為 25、50、100 μg·mL-1）。待細(xì)胞長至 80%左右，吸棄舊液，按各組要求加入含不同物質(zhì)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)48 h后取出細(xì)胞，按照1.2.8方法計算葡萄糖消耗量和細(xì)胞活力。

1.2.11 姜辣素對IR-HepG2細(xì)胞SOD和CAT活力的影響 使用1.2.10方法處理細(xì)胞，48 h后取出六孔板，去上清，用PBS清洗，加入細(xì)胞裂解液（含1 mmol/L 的 PMSF）150 μL，裂解 5 min，整個操作在冰上進(jìn)行。充分裂解后，收集裂解后的細(xì)胞8000 r·min-1離心5 min，取上清，根據(jù)試劑盒，測定蛋白濃度、SOD和CAT活力。

1.2.12 qRT-PCR檢測基因表達(dá) 使用1.2.10方法處理細(xì)胞，48 h后取出六孔板，去上清，用PBS清洗，使用TransZol up plus RNA Kit試劑盒提取細(xì)胞的RNA，然后使用HiScript? II Q RT SuperMix for qPCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA模板。qRT-PCR反應(yīng)體系為：cDNA 2 μL，上下游引物（表2）各 1 μL，ddH2O 6 μL，SYBR green Mix 10 μL。RT-PCR 反應(yīng)條件為：預(yù)變性 95 ℃ 5 min，循環(huán)擴(kuò)增 95 ℃ 15 s，60 ℃1 min（40 個循環(huán)），熔煉曲線 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

表2 qRT-PCR引物表Table 2 Primer sequence of qRT-PCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 26進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。組間比較采用LSD法，P＜0.05表示具有顯著性差異。作圖軟件采用Origin 2019。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜辣素提取單因素實驗

如圖1所示，姜辣素得率隨料液比的增加而增加。這是因為提取溶劑少，不能將姜辣素全部提取出來。當(dāng)料液比為1:40 g/mL時姜辣素得率最大，之后反而下降，這可能是因為乙醇增多，提取出來的脂類物質(zhì)也隨之增多。因此選取1:40 g/mL的料液比進(jìn)行下一步試驗。提取時間增加，姜辣素得率也隨之增加，之后略有減小。姜辣素得率在提取時間為60 min時達(dá)到最大。這表明姜辣素在60 min時已基本提取完全。乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時姜辣素得率最大，之后逐漸減小，這可能是因為姜辣素只有在合適的極性下才能被提取出來。因姜辣素為脂溶性物質(zhì)，所以選取乙醇體積分?jǐn)?shù)60%為最佳提取濃度。項敏[23]采用超聲輔助乙醇提取姜辣素，最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)也為60%。隨提取溫度升高，姜辣素得率也升高，但升高的趨勢逐漸趨于平緩，這可能是因為姜辣素的提取量已接近飽和。姜辣素在高溫下不穩(wěn)定[24]，選擇最佳提取溫度為50 ℃。張魯明等[25]采用乙醇提取姜辣素，單因素實驗結(jié)果為最佳乙醇濃度80%，最佳固液比為1:10（g/mL），最佳提取時間為3 h。這與本文得到的結(jié)果略有差異，可能與生姜的品種、采摘季節(jié)、實驗條件不同等有關(guān)。

圖1 料液比、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度對姜辣素得率的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio, extraction time, ethanol volume fraction and extraction temperature on the yield of gingerols

2.2 姜辣素提取的正交試驗結(jié)果

根據(jù)2.1實驗結(jié)果，采用L16（45）正交試驗表對姜辣素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。如表3所示，因素的極差越大，表明該因素的影響越大。因此，影響姜辣素得率的因素首先為乙醇體積分?jǐn)?shù)，其次為料液比、提取溫度和提取時間。由表4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對姜辣素得率影響最大（P＜0.01），其次為料液比（P＜0.05）。根據(jù)均值可得，姜辣素提取最佳條件為：料液比1:50 g/mL、提取時間80 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取溫度50 ℃。因最優(yōu)組合不在表3中，需進(jìn)行驗證試驗，驗證試驗的結(jié)果為姜辣素的得率為1.885%±0.071%，大于表中的得率。

表3 生姜姜辣素得率的正交試驗結(jié)果及極差分析Table 3 Orthogonal test results and range analysis of gingerols' yield

表4 姜辣素提取方差分析表Table 4 Analysis of variance of gingerols' extraction

姜辣素是生姜中呈辛辣味活性物質(zhì)的總稱，易溶于有機(jī)溶劑，難溶于水，且在高溫下不穩(wěn)定。姜辣素在生姜中含量較少，李田葉等[26]研究發(fā)現(xiàn)干姜中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚的含量分別為4.164、1.343、2.488 和 1.008 mg·g-1，其總和不到 1%。An等[19]研究發(fā)現(xiàn)新鮮生姜中6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的含量分別為 5.91、2.52和 2.62 mg·g-1，干燥后6-姜酚的含量大幅減少。這與本文得到的姜辣素含量相差不大，可能與生姜的種類及干燥方式有關(guān)[19]。

2.3 姜辣素分離純化實驗結(jié)果

根據(jù)高效液相色譜分析可得姜辣素中主要成分6-姜酚、8-姜酚和 10-姜酚的回歸方程為：6-姜酚：y=0.0672x+0.324，R2=0.9993；8-姜 酚 ：y=0.1084x-0.3075，R2=0.9999；10-姜酚：y=0.0765x-0.3123，R2=0.9994，以此作為定量依據(jù)。由表5可知，生姜姜辣素中的主要成分為6-姜酚，其次為10-姜酚和8-姜酚。通過乙醇提取得到的姜辣素粗提物中姜辣素含量不高，6-，8-，10-姜酚含量之和僅為4.98%。對姜辣素粗提物繼續(xù)進(jìn)行乙酸乙酯萃取和石油醚脫脂后，姜辣素含量大幅提高，6-，8-，10-姜酚的含量分別達(dá)到了 25.16%±0.78%、3.07%±0.10%和 6.32%±0.22%，其姜辣素含量大于34.55%。這表明姜辣素在乙酸乙酯和石油醚中具有更好的溶解性能。因此，選用乙醇提取、乙酸乙酯萃取和石油醚脫脂后的姜辣素進(jìn)行后續(xù)研究。

表5 不同溶劑分離姜辣素中6-，8-，10-姜酚的含量變化（%）Table 5 Changes of 6-, 8-, 10- gingerol content during separation and purification of gingerols (%)

2.4 姜辣素抗氧化活性

姜辣素和維生素C對DPPH和ABTS+自由基的清除率如圖2所示。生姜姜辣素和維生素C對DPPH和ABTS+自由基清除率隨濃度增加而增大，且在一定范圍內(nèi)具有線性關(guān)系。選取其清除率在50%附近的三個點，通過線性擬合曲線，得到姜辣素對DPPH 的EC50為0.501 mg·mL-1，VC為0.200 mg·mL-1，小于姜辣素的EC50。姜辣素對 ABTS+的EC50為0.111 mg·mL-1，VC為 0.057 mg·mL-1，也小于姜辣素的EC50。生姜姜辣素對DPPH和ABTS+自由基的EC50雖稍大于維生素C對DPPH和ABTS+的EC50，但仍表明姜辣素具有良好的抗氧化活性。Shukla等[27]也發(fā)現(xiàn)Sungro-sung生姜對DPPH自由基的清除率為91.25%，Thingpui生姜對ABTS+自由基的清除率為88.25%。劉步云等[28]發(fā)現(xiàn)永康黃姜和云南黃姜均具有極強的DPPH和ABTS+自由基清除能力。這可能都與生姜中的姜辣素有關(guān)。氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致多種疾病[29]，包括胰島素抵抗。抗氧化劑可以減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，達(dá)到預(yù)防相關(guān)疾病的目的。這表明姜辣素可作為一種良好的抗氧化劑預(yù)防由氧化應(yīng)激產(chǎn)生的胰島素抵抗。

圖2 姜辣素對DPPH和ABTS+自由基的清除率Fig.2 Elimination rate of gingerols against DPPH and ABTS+free radical

2.5 HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立

肝臟是人體代謝中心，是胰島素抵抗的重要靶器官。肝臟對維持機(jī)體內(nèi)葡萄糖動態(tài)平衡起著至關(guān)重要的作用，其通過調(diào)節(jié)糖原儲存、糖原分解和糖異生之間的平衡來維持血糖的正常水平[30]。因此，干擾肝臟葡萄糖合成與代謝最終可能導(dǎo)致代謝綜合征、非酒精性脂肪肝病及胰島素抵抗等病理改變。當(dāng)肝臟產(chǎn)生胰島素抵抗時，肝臟組織對胰島素的敏感性下降，葡萄糖的攝取及利用率也隨之下降[31]。

如表6所示，在24 h內(nèi)，各實驗組均不能使細(xì)胞葡萄糖消耗量降低。高胰島素處理48 h后，與對照組相比，各處理組細(xì)胞的葡萄糖消耗量均顯著下降（P＜0.05），且隨著胰島素濃度增大，其消耗量也逐漸減少。當(dāng)用25 μg·mL-1胰島素處理細(xì)胞48 h后，其葡萄糖消耗量降為 1.271±0.188 mmol·L-1，表明其達(dá)到了胰島素抵抗最大化。胰島素處理72 h后，25 μg·mL-1胰島素濃度能顯著降低 HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量（P＜0.05），其余處理組均無明顯變化。姜保平[32]研究發(fā)現(xiàn) 1×10-9、5×10-9、1×10-8、5×10-8、1×10-7、5×10-7mol·L-1胰島素作用 HepG2 細(xì)胞 48 h均能顯著降低細(xì)胞葡萄糖消耗量。Jiang等[21]采用100 nmol·L-1胰島素作用HepG2細(xì)胞12、24和36 h后，均能顯著降低葡萄糖消耗量，這表明HepG2細(xì)胞經(jīng)高胰島素誘導(dǎo)，能夠產(chǎn)生胰島素抵抗。因此，本實驗采用25 μg·mL-1胰島素處理HepG2細(xì)胞48 h來構(gòu)建細(xì)胞胰島素抵抗模型。

表6 不同濃度和時間的胰島素對HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響Table 6 Effects of different concentrations and time of insulin on glucose consumption in HepG2 cells

2.6 不同濃度姜辣素對HepG2細(xì)胞活性的影響

圖3為不同濃度姜辣素對HepG2細(xì)胞活力的影響。從圖3中可以看出，與空白組相比，6.25、12.5、25、50 和 100 μg·mL-1的姜辣素作用 HepG2 細(xì)胞48 h后，均對細(xì)胞活力無顯著性影響（P＞0.05），表明在此濃度范圍內(nèi)的姜辣素對HepG2細(xì)胞無毒性作用，細(xì)胞能正常生長。因此，本研究選擇25、50和100 μg·mL-1的姜辣素作為低、中、高劑量組進(jìn)行后續(xù)研究。

圖3 不同濃度姜辣素對HepG2細(xì)胞活性的影響Fig.3 Effects of different concentrations of gingerols on HepG2 cell activity

2.7 不同濃度姜辣素對HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

圖4為姜辣素對IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響。如圖4所示，模型組細(xì)胞葡萄糖消耗量明顯下降，影響顯著（P＜0.05），表明其發(fā)生了胰島素抵抗，當(dāng)用 25、50 和 100 μg·mL-1的姜辣素作用細(xì)胞后，能顯著改善細(xì)胞對葡萄糖的利用率（P＜0.05），且姜辣素的濃度越高，其葡萄糖的消耗量也越高。這表明，姜辣素具有預(yù)防細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗的作用，能夠顯著提高肝臟細(xì)胞對胰島素的敏感性，且高劑量組100 μg·mL-1的姜辣素效果最好。

圖4 不同濃度姜辣素對細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響Fig.4 Effects of different concentrations of gingerols on glucose consumption in cells

2.8 姜辣素對IR-HepG2細(xì)胞氧化指標(biāo)的影響

機(jī)體產(chǎn)生過量的自由基容易引起氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗，造成糖尿病及其并發(fā)癥。SOD和CAT在清除氧自由基和抑制氧化損傷中起重要作用。SOD又稱為Cu-Zn酶，它能催化超氧陰離子歧化生成氧和過氧化氫，維持體內(nèi)氧化和抗氧化平衡[4]。CAT能夠增強機(jī)體對羥基自由基及超氧陰離子的抑制能力，緩解由氧化應(yīng)激所造成的機(jī)體或功能性損傷[33]。

如圖5所示，與正常組相比，模型組HepG2細(xì)胞在高胰島素環(huán)境下，其超氧化物歧化酶SOD活力顯著下降（P＜0.05）。與模型組相比，姜辣素低、中、高劑量組均能顯著提高IR-HepG2細(xì)胞的SOD活力，并呈現(xiàn)劑量依賴性（P＜0.05）。與正常組相比，模型組細(xì)胞的過氧化氫酶（CAT）活力有所下降，低、中劑量姜辣素對胰島素抵抗細(xì)胞的CAT活力無顯著影響（P＞0.05），而高劑量 100 μg·mL-1的姜辣素能顯著提高細(xì)胞的CAT活力（P＜0.05）。模型組中SOD和CAT活力降低可能是因為過量葡萄糖的自動氧化產(chǎn)生了大量的羥基自由基和過氧化氫，而這些自由基能使抗氧化酶的活性部分失活[34]。這表明生姜姜辣素預(yù)防HepG2細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗可能是通過提高SOD和CAT活力，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖5 姜辣素對IR-HepG2細(xì)胞SOD和CAT活力的影響Fig.5 Effects of gingerols on SOD and CAT activities of IRHepG2 cells

2.9 姜辣素對IR-HepG2細(xì)胞糖類代謝的調(diào)節(jié)作用

目前，已有很多研究證明PI3K/AKT途徑是介導(dǎo)胰島素合成代謝的關(guān)鍵信號通路[35]。當(dāng)胰島素與胰島素受體結(jié)合時，胰島素受體底物IRS-2能夠激活PI3K，形成PIP3。IRS-2蛋白通過與胰島素受體上的磷酸酪氨酸殘基結(jié)合，將PI3K途徑與胰島素受體連接起來。PIP3通過3-磷酸肌醇依賴的蛋白激酶1激活A(yù)KT[36]。AKT是必需的下游信號激酶。肝臟中AKT的缺失會導(dǎo)致嚴(yán)重的胰島素抵抗、葡萄糖耐受和肝臟脂質(zhì)合成減少。AKT能夠通過抑制GSK-3β促進(jìn)糖原合成。除此之外，AKT也能通過抑制FoxO1，進(jìn)而抑制PEPCK的表達(dá)來抑制糖異生途徑[37]。Chen等[38]研究發(fā)現(xiàn)，牛磺酸能夠通過上調(diào)PI3K和AKT的表達(dá)來緩解HepG2細(xì)胞的胰島素抵抗，增加葡萄糖消耗量和改善氧化應(yīng)激反應(yīng)。Mazibuko-Mbeje等[39]采用羅漢果提取物處理胰島素抵抗大鼠，羅漢果提取物能顯著增強PI3K和AKT的表達(dá)，從而改善肝臟胰島素抵抗。

由圖6可知，與正常組相比，模型組中PI3K、IRS-2和AKT的mRNA表達(dá)量均有顯著下降（P＜0.05），模型組中GSK-3β、FoxO1和PEPCK的 mRNA表達(dá)量均有顯著上升（P＜0.05）。表明高濃度胰島素在一定程度上抑制了PI3K/AKT途徑，降低了肝臟利用葡萄糖的效率。與模型組相比，姜辣素劑量組均能顯著上調(diào)PI3K、IRS-2和AKT這些基因的表達(dá)量（P＜0.05），并能顯著下調(diào)GSK-3β、FoxOI和PEPCK的表達(dá)量（P＜0.05）。這結(jié)果表示姜辣素與胰島素抵抗細(xì)胞共培養(yǎng)能有效激活PI3K/AKT途徑，促進(jìn)PI3K、IRS-2和AKT的表達(dá)，進(jìn)而抑制GSK-3β、FoxO1和PEPCK的表達(dá)，促進(jìn)糖原合成，抑制糖異生，提高葡萄糖的利用率。

圖6 姜辣素對PI3K/AKT胰島素抵抗途徑主要基因表達(dá)量的影響Fig.6 Effects of gingerols on expression levels of major genes of PI3K/AKT insulin resistance pathway

3 結(jié)論

本文通過正交試驗確定了生姜姜辣素乙醇提取的最佳條件，其條件為料液比1:50 g/mL、提取時間80 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取溫度50 ℃。在此條件下，姜辣素的得率為1.885%±0.071%。對乙醇提取的姜辣素進(jìn)行乙酸乙酯萃取和石油醚脫脂后，姜辣素中主要成分6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的含量大幅提高，其總和達(dá)到了34.55%，是乙醇提取的6.94倍。將純化后的姜辣素作用于DPPH和ABTS+自由基，其 EC50分別為 0.501和 0.111 mg·mL-1，雖稍大于維生素C對DPPH和ABTS+自由基的清除率，但仍表明姜辣素具有良好的抗氧化活性。純化后的姜辣素與高濃度胰島素共同作用于HepG2細(xì)胞時，姜辣素各劑量組能明顯提高胰島素抵抗細(xì)胞的葡萄糖消耗量、SOD和CAT活力，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。通過檢測HepG2細(xì)胞內(nèi)與葡萄糖代謝相關(guān)的基因表達(dá)量可知，姜辣素能夠通過激活PI3K/AKT途徑來提高葡萄糖的利用率，預(yù)防高濃度胰島素引起的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗。這些研究為生姜姜辣素的制備及探究姜辣素對胰島素抵抗的緩解作用提供實驗依據(jù)，同時也對天然活性產(chǎn)物的藥理作用研究具有重要意義。