王途，孫曉旭，張乘云，崔海鵬，劉凱，謝亞芹，李穎，趙娟

（承德醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000）

動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis,AS）是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞的慢性炎癥疾病，以進(jìn)展性血管壁脂質(zhì)沉積為主要特征，其病變累及腎臟造成腎損傷，近年來受到人們的廣泛關(guān)注。人尾加壓素Ⅱ（UⅡ）受體拮抗劑——Urantide是一種由人尾加壓素Ⅱ（hUⅡ）衍生而來的多肽類化合物，能競爭性拮抗UⅡ?qū)χ鲃?dòng)脈強(qiáng)烈的收縮作用，以及對(duì)血管壁的促分裂作用[1]。信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子 3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）參與調(diào)節(jié)多器官病理生理過程，其在AS的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著非常重要的作用[2]。有文獻(xiàn)報(bào)道，通過抑制STAT3蛋白的表達(dá)可對(duì)腎疾病起到治療作用[3]。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)，Urantide可緩解AS的發(fā)展和改善AS斑塊的穩(wěn)定性，對(duì)AS大鼠的胸主動(dòng)脈和肝臟起到保護(hù)作用[4-5]。然而，Urantide對(duì)AS大鼠腎臟發(fā)揮何種作用，至今尚未定論。本文以AS大鼠為研究對(duì)象，初步探討Urantide對(duì)AS大鼠腎臟中STAT3信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

Wistar雄性大鼠（SPF級(jí)），體重180～ 200g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（京）-2016-0011；生產(chǎn)合格證號(hào)：11400700127208]。Urantide由蘇州強(qiáng)耀生物公司合成，辛伐他汀購自北京諾華制藥有限公司，RIPA裂解液和超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊科技有限公司，兔抗大鼠p-STAT3和鼠抗大鼠STAT3均購自美國Cell Signaling Technology公司，β-actin一抗、HRP標(biāo)記山羊抗兔或鼠二抗購自美國Bioworlde公司。

1.2 大鼠AS模型復(fù)制及實(shí)驗(yàn)分組

含高脂成分特制飼料的組成：基礎(chǔ)飼料，10%豬油，5%白糖，3.5%膽固醇，0.5%膽酸鈉，0.2%丙基硫氧嘧啶。

將120只健康Wistar雄性大鼠按照隨機(jī)原則分為2組：①正常組大鼠（30只），飼以普通飼料；②實(shí)驗(yàn)組大鼠（90只），實(shí)驗(yàn)開始時(shí)在飼以含高脂成分特制飼料基礎(chǔ)上，給予每只大鼠腹腔注射Vit D3150μg/（kg·d），持續(xù)3d。實(shí)驗(yàn)周期為4周。AS模型大鼠復(fù)制成功后，將AS大鼠再隨機(jī)分為模型組、辛伐他汀組、Urantide組，每組30只。正常組和模型組尾靜脈注射生理鹽水 30μg/（kg·d），持續(xù) 14d ；辛伐他汀組灌胃給予辛伐他汀 5μg/（kg·d），持續(xù) 14d ；Urantide 組尾靜脈注射 Urantide 30μg/（kg·d），持續(xù) 14d。

1.3 HE染色檢測胸主動(dòng)脈、腎組織形態(tài)學(xué)變化

將離體固定好的大鼠胸主動(dòng)脈、腎組織經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋后制備成石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，常規(guī)HE染色后光鏡下觀察病理形態(tài)學(xué)變化。

1.4 全自動(dòng)生化分析儀檢測大鼠血清學(xué)指標(biāo)

收集大鼠血液，經(jīng) 3000r/min 離心 10min 后取血清，經(jīng)全自動(dòng)生化分析儀檢測血清尿素氮（BUN）含量。

1.5 Western blotting檢測AS大鼠腎組織蛋白的表達(dá)水平

采用RIPA裂解液提取AS大鼠腎組織樣本的總蛋白，應(yīng)用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量。45μg蛋白于SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)膜和封閉，β-actin（1 ∶ 5000）、STAT3（1 ∶ 1000）、P-STAT3（1 ∶ 800）兔或鼠抗大鼠一抗4℃搖床孵育過夜；加入HRP標(biāo)記抗兔或鼠二抗（1∶5000），37℃搖床孵育 1h，TBST洗膜后用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。利用Image J光密度分析軟件對(duì)目的蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值的比值作為各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LDS-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠胸主動(dòng)脈的形態(tài)學(xué)變化

正常組大鼠血管內(nèi)皮邊緣整齊，中膜可見梭形平滑肌細(xì)胞，無泡沫細(xì)胞或脂質(zhì)類物質(zhì)沉積，彈力纖維層結(jié)構(gòu)完整清晰；模型組大鼠病變部位內(nèi)膜增厚，邊緣不整，血管內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂，在內(nèi)膜處平滑肌細(xì)胞增生明顯，有泡沫細(xì)胞堆積，為典型的AS病理組織形態(tài)改變。見圖1。

圖1 大鼠胸主動(dòng)脈的形態(tài)學(xué)變化 （HE×400）

2.2 Urantide對(duì)AS大鼠腎組織形態(tài)學(xué)改變的影響

正常組腎小管間質(zhì)正常無水腫表現(xiàn)，腎小球形態(tài)正常無萎縮或肥大表現(xiàn)且密度均一，腎小球囊壁與周圍組織界限清晰；模型組腎小管間質(zhì)水腫，腎小球萎縮且密度不均，腎小球囊壁與周圍組織粘連，為典型的AKI病理變化征象；與模型組比較，辛伐他汀組腎小管間質(zhì)水腫改善，腎小球萎縮程度減低且密度趨向一致，腎小球囊壁與周圍組織粘連程度減輕；Urantide組腎小管間質(zhì)水腫改善，腎小球萎縮程度減輕且密度趨于一致，腎小球囊壁與周圍組織粘連程度降低。見圖2。

2.3 大鼠血清中BUN變化情況

各組血清BUN水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=131.062，P=0.000）；與正常組 [（8.930±1.451）mmol/L]比較，模型組[（17.650±1.673）mmol/L]血清BUN含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組[（7.400±1.881）mmol/L]與Urantide組[（4.633±1.092）mmol/L]血清 BUN 含量降低（P＜0.05）。見圖3。

2.4 Urantide對(duì)AS大鼠腎組織中STAT3表達(dá)的影響

各組STAT3、p-STAT3表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（STAT3：F=64.120，P=0.000；p-STAT3 ：F=395.373，P=0.000）。與正常組比較，模型組大鼠腎臟中STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平增加（P＜0.05）。與模型組比較，辛伐他汀組 STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），Urantide組 STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。見附表和圖4、5。

圖2 大鼠腎組織的形態(tài)學(xué)變化 （HE×400）

圖3 大鼠血清 BUN 變化 （n=30，±s）

附表 各組STAT3、p-STAT3表達(dá)水平比較（n=30，±s）

附表 各組STAT3、p-STAT3表達(dá)水平比較（n=30，±s）

注：?與模型組比較，P＜0.05

組別 STAT3 p-STAT3正常組 0.955±0.021? 0.253±0.002?模型組 1.163±0.014 0.509±0.006辛伐他汀組 1.217±0.016? 0.627±0.006?Urantide組 0.658±0.011? 0.296±0.004?

圖4 各組大鼠STAT3和p-STAT3蛋白的表達(dá)

圖5 大鼠腎臟組織中STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)的變化 （n=30，±s）

3 討論

腎臟是參與機(jī)體代謝和循環(huán)系統(tǒng)最重要的器官，在AS的發(fā)生、發(fā)展過程中，腎臟的代償機(jī)制逐步損害最終導(dǎo)致腎臟功能受損，造成機(jī)體代謝產(chǎn)物的蓄積和循環(huán)系統(tǒng)的阻滯[6]。筆者在復(fù)制AS大鼠模型過程中，動(dòng)脈內(nèi)膜受到嚴(yán)重?fù)p傷導(dǎo)致流經(jīng)腎臟有效循環(huán)血容量減少而發(fā)生腎損傷，由于復(fù)制模型時(shí)間較短，主要以AKI為主[7]。本研究結(jié)果顯示，腎臟病理變化主要表現(xiàn)為腎小球萎縮以及腎小球囊壁與周圍組織黏連，腎小管間質(zhì)出現(xiàn)水腫，血清中BUN也升高，其為AKI的病理形態(tài)變化。

本研究前期發(fā)現(xiàn)，Urantide可抑制炎癥反應(yīng)、延緩AS發(fā)展和改善AS斑塊的穩(wěn)定性對(duì)胸主動(dòng)脈及肝臟起到保護(hù)作用[4-5，8]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，經(jīng)Urantide治療的AS大鼠腎小球萎縮現(xiàn)象改善、腎小管間質(zhì)水腫減輕且血清BUN含量降低，其效果接近于辛伐他汀，說明Urantide對(duì)AS大鼠腎臟也具有保護(hù)作用。

AS炎癥學(xué)說由德國病理學(xué)家VIRCHOW于1856年提出，該學(xué)說闡述AS發(fā)生、發(fā)展是動(dòng)脈內(nèi)膜的炎癥反應(yīng)，但未能引起人們注意。隨著AS病變研究的不斷深入，越來越多的炎癥相關(guān)因子在AS中被發(fā)現(xiàn)[9-10]。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，AS大鼠血液中hs-CRP的大量表達(dá)促進(jìn)機(jī)體炎癥的進(jìn)程[8]。STAT3信號(hào)通路是介導(dǎo)組織炎癥和細(xì)胞增殖的信號(hào)通路，促進(jìn)動(dòng)脈內(nèi)膜細(xì)胞增值以及參與血細(xì)胞生成、免疫過程中巨噬細(xì)胞的活化和極化過程，國內(nèi)外大量文獻(xiàn)報(bào)道，在發(fā)生AS時(shí)STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)升高[2，11-12]。本研究結(jié)果顯示，Urantide可降低AS大鼠腎臟組織中STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平，說明Urantide可通過抑制STAT3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)達(dá)到改善AS引起AKI所造成的損傷，使腎小球的功能得到好轉(zhuǎn)，進(jìn)而延緩AS的進(jìn)一步發(fā)展。

辛伐他汀不僅能夠增強(qiáng)AS斑塊的穩(wěn)定性，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[13]，而且還具有降脂、改善動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的功能和減弱炎癥細(xì)胞因子與趨化因子向AS斑塊聚集的作用，對(duì)腎臟具有保護(hù)作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可有效的保護(hù)腎臟以及降低AS大鼠血清中BUN的含量。然而，與Urantide不同的是，辛伐他汀未降低AS大鼠腎臟中STAT3、p-STAT3蛋白的表達(dá)，其結(jié)果與WANG等[15]關(guān)于肝臟研究中辛伐他汀對(duì)STAT3的抑制作用不同，筆者推測辛伐他汀對(duì)STAT3的抑制作用可能與機(jī)體或組織的不同有關(guān)，其相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，Urantide可通過抑制STAT3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)保護(hù)AS腎臟，進(jìn)而延緩AS的進(jìn)一步發(fā)展。而Urantide對(duì)AS所引起AKI病情改善的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，以期為Urantide治療AS并發(fā)AKI的臨床應(yīng)用提供有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。