丁佳玉，曲 敏，佟長(zhǎng)青，李 偉

（大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連 116023）

牡蠣別名蠣黃，是一種雙殼類軟體動(dòng)物。牡蠣主要生長(zhǎng)在溫帶和熱帶等沿海水域[1]。在我國(guó)牡蠣的分布也很廣泛，其養(yǎng)殖范圍由北至南，且生長(zhǎng)在咸淡水交界處的牡蠣尤為肥美。牡蠣具有良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，牡蠣中含有豐富的微量元素、糖原，具有保肝護(hù)肝[2]、降血糖、降尿糖[3]等生理活性。

硒是人體生命活動(dòng)中必需的微量元素之一，經(jīng)研究表明適當(dāng)補(bǔ)硒能夠延緩衰老、抗氧化、抑制或協(xié)同抗腫瘤等[4-5]。根據(jù)研究顯示，有機(jī)硒與無機(jī)硒相比能降低其毒性，提供更好的抗氧化、抗腫瘤能力[6-7]。

目前，對(duì)于硒化多糖的抗腫瘤活性研究并不多。商龍臣等人[8]用南瓜硒多糖作用于乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，給藥48 h后效果最好，抑制率可達(dá)到50.3%，較好地抑制了癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Weili Zhu等人[9]研究何首烏酸性多糖，結(jié)果表明何首烏酸性多糖具有很好的抗腫瘤、抗氧化能力，是一種潛在的抗氧化劑、抗腫瘤藥物。Fei Liu等人[10]研究硒化后的蛹蟲草多糖抑制肝癌細(xì)胞，分離后的硒化蛹蟲草多糖對(duì)肝癌細(xì)胞具有一定的抑制作用。Hui-Li Chu等人[11]發(fā)現(xiàn)馬尾松（Pinus massoniana）花粉硫酸化多糖（SPPM60） 在HepG2細(xì)胞G2/M期對(duì)其具有抑制作用，并且抑制率與藥物濃度呈依賴性。Guowei Ya[12]發(fā)現(xiàn)純化的香菇多糖通過線粒體通路可有效誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。

硒與牡蠣多糖經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)，使所得多糖中含有Se=C鍵或Se-O，從而形成有機(jī)硒化合物——牡蠣硒多糖，實(shí)現(xiàn)牡蠣多糖硒化。研究硒化牡蠣多糖清除DPPH·，ABTS+，·OH清除率及鐵還原力等體外抗氧化活性，以及對(duì)人宮頸癌和肝癌細(xì)胞的抑制作用，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)并探討抑制腫瘤細(xì)胞的機(jī)制，為牡蠣深加工及產(chǎn)業(yè)化提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡蠣多糖干粉（實(shí)驗(yàn)室自制）；氯仿、正丁醇、亞硒酸鈉、乙醇、高氯酸、濃鹽酸、濃硝酸、硒標(biāo)準(zhǔn)、鄰苯二胺、檸檬酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、DPPH·、抗壞血酸、ABTS+、K2S2O8、無水乙醇、FeSO4、水楊酸、30%H2O2溶液等，均為分析純；甲醇色譜純；DMSO（細(xì)胞級(jí)）、1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、青鏈霉素混合液、PI染液和RNase A，北京索萊寶科技有限公司提供；胎牛血清，杭州四季青生物工程有限公司提供；人宮頸癌細(xì)胞株（Hela）、人肝癌細(xì)胞株（HepG2），中科院上海細(xì)胞所提供。

1.2 儀器與設(shè)備

立式冷凍離心機(jī)，鹽城市安信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；PB-10型Sartorius精密pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司產(chǎn)品；UV-2550型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司產(chǎn)品；370DTGS型紅外光譜儀，Thermo公司產(chǎn)品；721型可見光分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品；MCO-18AIC型CO2培養(yǎng)箱，日本三洋設(shè)備有限公司產(chǎn)品；CKX41型倒置顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司產(chǎn)品；Fax2100型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，美國(guó)Awareness公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀，Beckman公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 硒化牡蠣多糖的制備

精確量取1.0 g采用Sevage法除蛋白后的牡蠣多糖放入三頸瓶中，加入0.5%硝酸溶液和一定質(zhì)量的亞硒酸鈉并在70℃水浴鍋中攪拌反應(yīng)8 h；待反應(yīng)后溶液降到室溫，調(diào)pH值至中性；取4倍體積95%的乙醇進(jìn)行醇沉，過夜后離心（9 000 r/min，10 min），取沉淀透析3 d；冷凍干燥得硒化牡蠣多糖。

1.3.2 硒化牡蠣多糖的分離純化

將處理好的DEAE-52裝柱，柱床規(guī)格為2.5 cm×40 cm。硒多糖上樣量為10 mg/mL，流速為3 min 2 mL，采用濃度為0～0.5 mol/L NaCl洗脫。苯酚硫酸法檢測(cè)多糖含量并收集各主峰，透析3 d，冷凍干燥得純化的硒化牡蠣多糖。

1.3.3 硒含量測(cè)定

參考葛明明等人蒲公英硒化多糖工藝，采用HPLC法，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)Y、硒標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，繪制硒溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定硒化牡蠣多糖中的硒含量。

了解大學(xué)生的閱讀需求，閱讀推廣工作才能有的放矢。隨著技術(shù)的發(fā)展，通過大數(shù)據(jù)分析，為挖掘大學(xué)生的潛在需求提供了技術(shù)支持。新媒體時(shí)代下大學(xué)生的閱讀具有碎片化、娛樂化、功利性的特點(diǎn)，這就需要高校圖書館在推廣閱讀服務(wù)時(shí)提供高效、快捷的服務(wù)，在閱讀推廣中應(yīng)注重新媒體的趣味性與專業(yè)性相結(jié)合，深度挖掘大學(xué)生的信息，提供智能化、個(gè)性化的服務(wù)，提高大學(xué)生讀者對(duì)圖書館的粘合性[6]。

1.3.4 體外抗氧化活性試驗(yàn)

（1） DPPH·清除能力測(cè)定。取2 mL不同質(zhì)量濃度牡蠣硒多糖溶液與0.1 mmol/L DPPH·溶液2 mL混合，避光30 min，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度，記為A1。以無水乙醇代替DPPH·，記為A0。蒸餾水代替樣品記為A2。

（2） ABTS+清除率測(cè)定。取 0.4 mL不同濃度牡蠣硒多糖溶液與1.6 mL ABTS+工作液混合，避光靜置6 min于波長(zhǎng)517 nm處用分光光度計(jì)測(cè)定樣液吸光度，記為A1。PBS（pH值7.4，磷酸緩沖溶液）代替樣品，記為A0；PBS代替ABTS+記為A2.

（3）·OH清除率測(cè)定。取2 mL不同濃度牡蠣硒多糖溶液與9 mmol/L FeSO4溶液1 mL，9 mmol/L水楊酸-乙醇1 mL，8.8 mmol/L過氧化氫1 mL，于37℃下反應(yīng)30 min，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度Ax；蒸餾水代替樣液吸光度A0；蒸餾水代替過氧化氫記為Ax0。

（4）鐵還原能力測(cè)定。取1 mL牡蠣硒多糖溶液與0.2 mol/L pH值6.6磷酸鹽緩沖液2.5 mL，1%鐵氰化鉀1 mL，于50℃下反應(yīng)20 min，加入10%三氯乙酸5 mL靜置10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水，0.1%三氯化鐵0.5 mL，靜置10 min。

于波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定吸光度A1。用去離子水代替0.1%三氯化鐵記為A2。

1.3.5 體外腫瘤生長(zhǎng)抑制

采用MTT法對(duì)HepG2及Hela細(xì)胞存活生長(zhǎng)率進(jìn)行測(cè)定。取對(duì)數(shù)期的腫瘤細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2×104個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔90 μL，培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁。加入終質(zhì)量濃度分別為25，50，100，200 μg/mL的硒化牡蠣多糖，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，另外設(shè)陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，于37℃，5%條件下的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入0.5%的MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO（細(xì)胞級(jí)），振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定各孔的吸光度計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞周期

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞1×105濃度接種于6孔板，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁，加入終質(zhì)量濃度為200 μg/mL的硒化牡蠣多糖繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用EP管收集培養(yǎng)液，胰酶消化剩余貼壁細(xì)胞，將培養(yǎng)液加入原孔中終止消化以轉(zhuǎn)速1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞。用PBS清洗3次，每次清洗后均用離心，棄上清液。將細(xì)胞固定于預(yù)冷的70%乙醇中過夜。次日離心除去固定劑，PBS清洗2次后，重新將細(xì)胞懸于含有PI及無DNA酶污染的RNase的染液中，于37℃，5%條件下CO2的培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒化牡蠣多糖DE-52分離純化

硒化牡蠣多糖DEAE-52的洗脫曲線見圖1。

圖1 硒化牡蠣多糖DEAE-52的洗脫曲線

由圖1可知，硒化牡蠣多糖經(jīng)DEAE-52層析分離獲得2個(gè)組分SeOPS-I和SeOPS-II。

2.2 硒化牡蠣多糖硒含量的測(cè)定及紅外光譜分析

采用HPLC法測(cè)得硒含量為42.36 mg/g，硒化牡蠣多糖平均收率為26.03%。

牡蠣多糖紅外光譜見圖2，硒化牡蠣多糖紅外光譜圖見圖3。

圖2 牡蠣多糖紅外光譜

由圖2和圖3可知，硒化后的牡蠣多糖紅外光譜在762 cm-1處和1 030 cm-1處出現(xiàn)峰，在762 cm-1處和1 030 cm-1處附近有亞硒酸酯特征吸收峰，表明硒化牡蠣多糖分子中存在亞硒酸基團(tuán)，可推斷硒化反應(yīng)后的牡蠣多糖中含有Se=O鍵，即硒化反應(yīng)后生成牡蠣硒多糖。

圖3 硒化牡蠣多糖紅外光譜圖

2.3 硒化牡蠣多糖的體外抗氧化活性

硒化牡蠣多糖對(duì)DPPH·清除作用見圖4，硒化牡蠣多糖對(duì)ABTS+清除作用見圖5。

圖4 硒化牡蠣多糖對(duì)DPPH·清除作用

圖5 硒化牡蠣多糖對(duì)ABTS+清除作用

由圖4和圖5可知，硒化牡蠣多糖對(duì)DPPH·和ABTS+都有很好的清除作用。清除效果與多糖濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。以VC作為參照，硒化牡蠣多糖對(duì)DPPH·的清除率IC50值為7.102 mg/mL。當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)清除能力達(dá)到70.9%。而對(duì)ABTS+的IC50值可達(dá)到2.243 mg/mL。當(dāng)質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)，硒化牡蠣多糖清除率為90.4%。這說明硒化后牡蠣多糖對(duì)ABTS+有很好的清除作用。

硒化多糖對(duì)·OH的清除作用見圖6。

圖6 硒化多糖對(duì)·OH的清除作用

硒化牡蠣多糖對(duì)·OH的清除率也隨質(zhì)量濃度的增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，但當(dāng)質(zhì)量濃度增加到20 mg/mL時(shí)，其清除率僅為44.9%。參考郝苗等人對(duì)硒化枸杞多糖的報(bào)道，當(dāng)質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí)，硒化枸杞多糖對(duì)·OH的清除率就達(dá)到56.16%。結(jié)果對(duì)比說明硒化牡蠣多糖對(duì)·OH清除效果并不理想。

硒化多糖對(duì)鐵還原力見圖7。

圖7 硒化多糖對(duì)鐵還原力

硒化后的牡蠣多糖具有一定的鐵還原力，還原力也是潛在抗氧化的重要表現(xiàn)。根據(jù)研究比較質(zhì)量濃度為2 mg/mL的硒化牡蠣多糖其還原力與牡蠣多糖相近，二者還原力無明顯差別。

2.4 硒化牡蠣多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制

牡蠣多糖和硒化牡蠣多糖對(duì)Hela生長(zhǎng)抑制作用（n=4） 見表 1。

表1 牡蠣多糖和硒化牡蠣多糖對(duì)Hela生長(zhǎng)抑制作用（n=4）

由表1可知，質(zhì)量濃度25～200 μg/mL牡蠣多糖（OPS）對(duì)宮頸癌細(xì)胞并沒有抑制作用。而硒化后的牡蠣多糖（SeOPS-II）作用于宮頸癌細(xì)胞具有一定的抑制作用，且抑制作用與SeOPS-II質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。SeOPS-II質(zhì)量濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)，對(duì)肝癌細(xì)胞抑制率為25.23%，抑制作用顯著提高。

牡蠣多糖和硒化牡蠣多糖對(duì)HepG2生長(zhǎng)抑制作用 （n=4） 見表2。

表2 牡蠣多糖和硒化牡蠣多糖對(duì)HepG2生長(zhǎng)抑制作用（n=4）

由表2可知，OPS對(duì)HepG2細(xì)胞增殖具有抑制效果，但效果并不顯著。而修飾后的SeOPS-II對(duì)HepG2細(xì)胞在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)生長(zhǎng)抑制作用較為顯著，并且抑制作用與質(zhì)量濃度成正比，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)，抑制作用可達(dá)到22.6%，具有顯著差異性p＜0.01。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果

Hela細(xì)胞周期分布圖見圖8，硒多糖作用Hela細(xì)胞周期分布圖見圖9，Hela細(xì)胞周期分布見圖10。

圖8 Hela細(xì)胞周期分布圖

圖9 硒多糖作用Hela細(xì)胞周期分布圖

通過PI單染色法對(duì)Hela細(xì)胞加藥前后細(xì)胞周期進(jìn)行比較。由圖10可知，細(xì)胞在G1期、S期和G2/M期均有分布，每個(gè)時(shí)期的細(xì)胞數(shù)量分別為67.3%±0.01%，28.88%±0.02%和3.82%±0.01%。

加入硒化牡蠣多糖作用48 h后（見圖9），Hela細(xì)胞主要集中在G1期。與對(duì)照組相比，G1期的細(xì)胞數(shù)量相對(duì)増多，已經(jīng)達(dá)到72.12%±0.01%；S期和G2/M期的細(xì)胞分布減少，S期的細(xì)胞量減少到25.28%±0.01%，G2/M期的細(xì)胞減少到2.59%±0.01%。經(jīng)比較分析，加入硒多糖后Hela細(xì)胞主要停滯在G1期，促使損害后的堿基無法復(fù)制，從而使進(jìn)入S期及G2/M期的細(xì)胞數(shù)減少，阻礙了細(xì)胞周期發(fā)展，從而達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的目的。

HepG2細(xì)胞周期分布圖見圖11，硒多糖作用HepG2細(xì)胞周期分布圖見圖12，HepG2細(xì)胞周期分布圖見圖13。

圖10 Hela細(xì)胞周期分布

圖11 HepG2細(xì)胞周期分布圖

圖12 硒多糖作用HepG2細(xì)胞周期分布圖

圖13 HepG2細(xì)胞周期分布圖

通過PI單染色法對(duì)HepG2細(xì)胞加藥前后細(xì)胞周期進(jìn)行比較。由圖13可知，相對(duì)于空白組，硒化牡蠣多糖組G0/G1期細(xì)胞少量增加，S期細(xì)胞由原來32.29%±0.02%增加到35.11%±0.02%，M期細(xì)胞由原來的12.87%±0.02%變?yōu)?.64%±0.02%，細(xì)胞數(shù)明顯減少。說明硒化牡蠣多糖主要作用于HepG2細(xì)胞S期來抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)對(duì)G0/G1期也具有一定作用。

3 結(jié)論

通過化學(xué)方法將有機(jī)硒與牡蠣多糖結(jié)合，并通過HPLC法及紅外對(duì)硒含量及硒多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析驗(yàn)證牡蠣多糖硒化。在抗氧化方面，硒化牡蠣多糖對(duì)部分指標(biāo)具有很好的抗氧化活性。經(jīng)研究表明，部分硒多糖具有強(qiáng)大的抗氧化特性，含硒多糖可考慮作為膳食補(bǔ)充劑中的新型硒源。在抗腫瘤方面，硒化牡蠣多糖在一定范圍內(nèi)對(duì)Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞增殖具有抑制作用且呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性。細(xì)胞周期結(jié)果顯示硒化牡蠣多糖可通過阻礙細(xì)胞G0/G1期及S期的發(fā)育從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。合理范圍內(nèi)攝入硒多糖可以提高人體免疫力。