解飛翔，袁偉鈺，石佩星，位石頭，李寶庫*

(1. 河北大學(xué)藥學(xué)院，河北保定 071002；2. 河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002)

植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的活性物質(zhì)，利用這一特性，從藥用植物內(nèi)生真菌中挖掘活性代謝產(chǎn)物已成為開發(fā)天然藥物的新途徑[1]。竹子具有許多優(yōu)良的藥用價(jià)值，但對(duì)其內(nèi)生真菌的研究還不多見[2]。因此，筆者對(duì)竹子內(nèi)生真菌尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化與鑒定，為尋找天然藥物先導(dǎo)化合物奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試材該試驗(yàn)所用菌種為竹子的植物內(nèi)生真菌Fusariumoxysporum，采集于泰國清邁湄賽村 (Mae Sae Village, Chiang Mai)，編號(hào)DDQ-31，保存于河北大學(xué)藥物化學(xué)與分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種庫。

1.2儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-210(BUCHI)；核磁共振儀(BRUKER)；恒溫?fù)u床ZHWY(上海智城分析儀器有限公司)；超凈工作臺(tái)ZHJH-C1112C(上海智城分析儀器有限公司)；U3000型高效液相色譜儀(Thermo Fisher)；柱層析硅膠(青島海洋化工廠)；薄層層析硅膠板(煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所)；Sephadex LH-20(GE Healthcare)。

1.3菌種的發(fā)酵及代謝產(chǎn)物的提取分離

1.3.1培養(yǎng)基的制備。PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 6.5，115 ℃滅菌15 min。大米固體培養(yǎng)基：每瓶80 g大米，加自來水100 mL，浸泡12 h后，121 ℃滅菌20 min。

1.3.2菌種的發(fā)酵。將菌種DDQ-31接種到PDA液體培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫?fù)u床中150 r/min培養(yǎng)5 d，得到2 L種子液。將2 L種子液以5%的接種量接種到大米培養(yǎng)基中(共40 L)，室溫培養(yǎng)45 d，得到固體發(fā)酵物。

1.3.3代謝產(chǎn)物的提取分離。將固體發(fā)酵物置于萃取桶中，加入1.5倍體積的乙酸乙酯萃取，每隔24 h萃取一次，共萃取6次，合并萃取液，減壓濃縮得到浸膏89 g。浸膏采用中壓硅膠柱層析(200～300目)進(jìn)行分離，用石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(100:0～0:100(V/V))梯度洗脫，經(jīng)TLC檢測后合并，共得到Fr1～Fr6組分。再經(jīng)過反復(fù)硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠分離、HPLC制備等方法分離得到化合物1～9。

2 結(jié)果與分析

該試驗(yàn)通過對(duì)Fusariumoxysporum進(jìn)行大米發(fā)酵培養(yǎng)，并運(yùn)用硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠色譜、制備液相色譜等方法進(jìn)行分離純化，從該菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離得到9個(gè)化合物，分別是化合物1(15.7 mg)、化合物2(22.5 mg)、化合物3(11.6 mg)、化合物4(18.3 mg)、化合物5(13.8 mg)、化合物6(31.5 mg)、化合物7(52.7 mg)、化合物8(14.7 mg)、化合物9(9.7 mg)?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 化合物1～9的化合結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of compounds 1～9

2.1化合物1C10H12O3，硫酸香草醛顯色為粉紅色，ESI-MSm/s181.21[M+H]+，1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δH:7.533 (1H, d,J=1.8Hz, H-2), 7.573 (1H, dd,J=8.3, 1.9Hz, H-6), 6.893 (1H, d,J=8.3Hz, H-5), 2.573 (3H, s, H-8), 3.953 (3H, s, H-9), 3.943 (3H, s, H-10)。13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δC: 196.84 (C-7), 149.02 (C-3), 153.34 (C-4), 130.53 (C-1), 110.13 (C-2), 123.22 (C-6), 109.93 (C-5), 56.13 (C-9), 26.22 (C-8), 56.04 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[3]中數(shù)據(jù)一致，確定化合物為1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-ethanone。

2.2化合物2C12H13NO2，硫酸香草醛顯色為紫色，ESI-MSm/s204.24[M+H]+，1H-NMR(600 MHz, CDCl3)δH: 8.081 (1H, s, -NH), 7.332 (1H, d,J=8.1Hz, H-8), 7.621 (1H, d,J=7.8Hz, H-5), 7.192 (1H, t,J=7.5Hz, H-7), 4.172 (2H, q,J=7.1Hz, H-12), 7.151-7.102 (2H, m, H-2, 6), 3.761 (2H, s, H-10), 1.262 (3H, t, J=7.1Hz, H-13)。13C-NMR(150 MHz, CDCl3)δC:172.24 (C-11), 127.33 (C-2), 136.13 (C-9), 123.04 (C-7), 118.93 (C-4), 122.24 (C-6), 119.62 (C-5), 111.23 (C-8), 60.84 (C-12), 108.63 (C-3), 31.42 (C-10), 14.34 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]中數(shù)據(jù)一致，確定化合物為吲哚-3-乙酸乙酯。

2.3化合物3C10H9NO2，硫酸香草醛顯色為紫色，ESI-MSm/s176.19[M+H]+，1H-NMR(600 MHz, CD3OD)δH: 7.533 (1H, d,J=7.9Hz), 7.153 (1H, s, H-2), 7.333 (1H, d,J=8.1Hz), 7.093 (1H, t,J=7.5Hz), 3.723 (2H, s), 7.013 (1H, t,J=7.4Hz)。13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δC: 176.52 (C-11), 128.72 (H-8), 138.03 (C-9), 124.62 (C-2), 119.81 (C-6), 122.43(C-5), 119.52 (C-4), 108.91 (C-3), 112.23 (C-7), 32.03 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]中數(shù)據(jù)一致，確定該化合物為吲哚-3-乙酸。

2.4化合物4C10H9NO，ESI-MSm/s160.19[M+H]+，1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δH: 9.902 (1H, s, H-10), 8.002 (1H, s, H-2), 8.152 (1H, d,J=8.1Hz, H-5), 7.482 (1H, d,J=8.0Hz, H-8), 7.232 (1H, t,J=7.4Hz, H-7), 7.272 (1H, t,J=7.2Hz, H-6)。13C-NMR (150 MHz, CD3OD),δC: 187.54 (C-10), 139.05 (C-9), 139.73 (C-2), 125.74 (C-8), 122.43 (C-5), 125.04 (C-6), 123.62 (C-4), 113.25 (C-7), 120.14 (C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]中數(shù)據(jù)一致，確定化合物為吲哚-3-乙酮。

2.5化合物5C11H11NO2，硫酸香草醛顯色為紫色，ESI-MSm/s190.21[M+H]+，1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δH: 8.103 (1H, s, -NH), 7.313 (1H, d,J=8.1Hz, H-8), 7.603 (1H, d,J=7.7Hz, H-5), 7.133 (1H, t,J=7.5Hz, H-6), 7.193 (1H, t,J=7.5Hz, H-7), 7.092 (1H, s, H-2), 3.703 (3H, s, H-12), 3.782 (2H, s, H-10)。13C-NMR (150 MHz，CDCl3)δC: 172.74 (C-11), 127.25 (C-2), 136.23 (C-9), 123.24 (C-7), 119.73 (C-5), 122.24 (C-6), 118.82 (C-4), 111.34 (C-8), 52.05 (C-12), 108.33 (C-3), 31.24 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]中數(shù)據(jù)一致，確定化合物為吲哚-3-乙酸甲酯。

2.6化合物6C10H12O4，ESI-MSm/s197.21[M+H]+，1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δH: 7.032 (2H, d,J=8.4Hz, H-3, 5), 4.302 (2H, dd,J=7.5, 5.1Hz, H-8), 6.692 (2H, d,J=8.4Hz, H-26), 2.942 (1H, dd,J=13.9, 5.1Hz, H-7), 3.672 (3H, s, H-10), 2.822 (1H, dd,J=13.9, 7.6Hz, H-7)。13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δC: 175.84 (C-9), 131.53 (C-3, 5), 157.24 (C-4), 129.24 (C-1), 73.42 (C-8), 116.03 (C-2, 6), 40.94 (C-7), 52.32 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]中數(shù)據(jù)一致，確定化合物為 latifolicinin C。

2.7化合物7C45H57N3O9，APCI-MSm/s784[M+H]+，1H-NMR(600 MHz, CDCl3)δH: 7.221 (4H, m), 5.651 (1H, d,J=9.4Hz), 7.161 (1H, m), 4.821 (1H, d,J=8.6Hz), 3.561 (1H, m), 3.381 (1H, d,J=13.8Hz), 3.471 (2H, s), 3.041 (3H, s), 2.941 (1H, t,J=13.3Hz), 0.821 (3H, d,J=6.1Hz), 1.941 (1H, m), 0.331 (1H, d,J=6.5Hz)。13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δC: 169.92, 136.41, 169.72, 128.73, 126.71, 128.53, 75.54, 34.62, 56.84,50.23, 31.91, 17.12, 29.73, 18.33。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]中一致，確定化合物為白僵菌素。

2.8化合物8C3H10N4O，APCI-MSm/s117[M-H]-，1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δH: 2.562 (6H, s)。13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δC: 76.31, 29.82。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]中數(shù)據(jù)一致，確定化合物為1, 3-diamino-1, 3-dimethylurea。

2.9化合物9C4H10O2，1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δH: 3.522 (2H, m), 1.112 (6H, d,J=6.1Hz)。13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δC: 72.71, 18.93。這此數(shù)據(jù)與化合物2,3-丁二醇的數(shù)據(jù)一致，確定化合物為2,3-丁二醇。

3 結(jié)論

該研究對(duì)竹子內(nèi)生真菌尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum乙酸乙酯提取物進(jìn)行分離純化，得到9個(gè)化合物。結(jié)合化合物的理化性質(zhì)和波譜分析對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，分別為4個(gè)吲哚衍生物：吲哚-3-乙酸乙酯(2)、吲哚-3-乙酸(3)、吲哚-3-乙酮(4)、吲哚-3-乙酸甲酯(5)；2個(gè)苯環(huán)衍生物：1-(3, 4-二甲氧基苯基)-乙酮(1)、latifolicinin C(6)；1個(gè)環(huán)肽類化合物：白僵菌素(7)；1個(gè)脲類化合物：1，3-diamino-1,3-dimethylurea(8);1個(gè)醇類化合物：2, 3-丁二醇(9)。其中，除化合物3、7、9外，其余化合物均為首次從竹子內(nèi)生真菌Fusarium oxysporum中分離得到。