韓文冰，明凱利，馬 躍，呂晉江，張波濤*

(1.青島大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東青島，266071；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都 611130；3.青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東青島 266042)

隨著化石能源漸趨枯竭和環(huán)境不斷惡化，尋求對(duì)環(huán)境友好的新能源，走可持續(xù)發(fā)展的道路已引起各國的普遍重視。植物細(xì)胞壁中含有豐富的纖維素多糖資源，利用“綠色生物化工” 技術(shù)可將其轉(zhuǎn)化為乙醇等[1]，作為一種可再生的生物資源，具有極高的研究?jī)r(jià)值和開發(fā)利用的現(xiàn)實(shí)意義。對(duì)生物質(zhì)原料的研究和開發(fā)已成為當(dāng)前能源領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

當(dāng)前，在“不與人爭(zhēng)糧，不與糧爭(zhēng)地”的原則下，我國第2代乙醇生物質(zhì)原料的研究取得了重大進(jìn)展，主要是以廢棄的農(nóng)作物秸稈(麥稈、稻草稈、玉米稈等)為代表，但仍面臨著諸多困難，其中生物質(zhì)原料的來源及成本，是生物能源發(fā)展中的重要瓶頸之一，所以現(xiàn)在科學(xué)家把目光投向成本更為低廉、來源更廣泛的木質(zhì)纖維素原料[2]。我國作為一個(gè)海洋大國，有著豐富的自然生長(zhǎng)的海濱植物，對(duì)其進(jìn)行開發(fā)，不僅可極大地豐富生物質(zhì)原料的來源，同時(shí)也可以降低原料成本，具有重要的意義。以秸稈為對(duì)照，從纖維成分含量和酸化酶解后的糖含量上對(duì)蘆葦、海帶、滸苔等3種海濱植物作為產(chǎn)乙醇原料的可行性進(jìn)行比較，并對(duì)其中纖維素含量較高的蘆葦進(jìn)行糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇的初步試驗(yàn)，為進(jìn)一步研究提供試驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料蘆葦、海帶、滸苔等均來自黃海海濱青島段，玉米秸稈來自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，其中蘆葦、玉米秸稈為秋季采收的枯稈，海帶、滸苔為春夏季收集。

將干燥的蘆葦稈、玉米秸稈用粉碎機(jī)粉碎，并過40目篩作為試驗(yàn)樣品備用；將采集的海帶、滸苔洗凈除去泥砂及雜質(zhì)，干燥研碎后，過40目篩作為試驗(yàn)樣品備用。

1.2樣品成分測(cè)定方法對(duì)王玉萬等[3]和杭怡瓊等[4]的方法進(jìn)行改良，對(duì)樣品中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等進(jìn)行系統(tǒng)定量分析。

準(zhǔn)確稱取1 g樣品，分別經(jīng)中性洗滌劑處理、2 mol/L鹽酸水解處理、72%硫酸酸化處理、高溫灰化處理等連續(xù)處理步驟，每步處理后的殘?jiān)稍镏梁庵兀謩e為W1、W2、W3、W4，每個(gè)樣品成分測(cè)定至少3組平行，結(jié)果取平均值。用以下公式計(jì)算半纖維素、纖維素、木質(zhì)素含量：

半纖維素(%)=(W1-W2)/樣品重×100%

纖維素(%)=(W2-W3)/樣品重×100%

木質(zhì)素(%)=(W3-W4)/樣品重×100%

1.3樣品酶解糖化試驗(yàn)方法

1.3.1酶解試驗(yàn)。樣品按5 g：100 mL(2%硫酸)的料液量，裝入三角瓶中封口，121 ℃高溫處理1 h，冷卻后，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH為5.0左右。以20 IU/g樣品的酶量，加入纖維素酶(測(cè)得酶活為35.0 IU)，放入120 r/min、48 ℃搖床中酶解52 h。分別取酶解0 h和52 h的酶解液適量，離心后取上清糖化液，分別測(cè)還原糖和木糖濃度。

1.3.2還原糖的測(cè)定方法。還原糖含量的測(cè)定采用DNS(3，5-二硝基水楊酸)法[5]。

1.3.3木糖的測(cè)定方法。木糖的測(cè)定采用地衣酚-鹽酸法，具體參考李胤等[6]的方法。

1.4乙醇發(fā)酵試驗(yàn)方法

1.4.1酶解發(fā)酵試驗(yàn)。樣品按10 g：100 mL(2%硫酸)的料液量，酶解48 h后，離心得糖化液。具體方法同1.3.1。

發(fā)酵培養(yǎng)基：糖化液、酵母粉0.3%、蛋白胨0.5%、尿素0.02%、磷酸氫二銨0.01%。115 ℃滅菌30 min。發(fā)酵條件：酵母(購自安琪公司)活化液接種量10%，溫度34 ℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)。分別在發(fā)酵20 h和44 h時(shí)無菌取適量的發(fā)酵液，離心后取上清液，測(cè)定乙醇含量。

1.4.2乙醇測(cè)定。采用氣相色譜(GC)用外標(biāo)法對(duì)乙醇含量進(jìn)行測(cè)定。氣相色譜條件為：進(jìn)樣口溫度150 ℃；進(jìn)樣量0.5 mL；載氣He2流量1 mL/min；柱溫由50 ℃程序升溫至100 ℃；FID檢測(cè)器溫度220 ℃；燃?xì)釮2流量40 mL/min；空氣流量400 mL/min；色譜柱為DB-624，30 m×250 μm×1.4 μm。

2 結(jié)果與分析

2.1各樣品成分含量由圖1可知，蘆葦中纖維素和半纖維素含量較高，分別為34.60%和32.60%，高于對(duì)照樣秸稈的33.60%和29.00%；滸苔中半纖維素的含量較高，達(dá)到了39.40%；海帶中纖維素和半纖維素的含量均偏低。纖維素和半纖維素作為多糖資源，可以降解為單糖，進(jìn)而利用單糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇。以蘆葦中纖維素為例計(jì)算，在完全理想的情況下，即纖維素完全轉(zhuǎn)化為葡萄糖，產(chǎn)生的葡萄糖完全發(fā)酵為乙醇，則10 t蘆葦可產(chǎn)生乙醇約1.96 t，即使轉(zhuǎn)化率為50%，也可生成約1 t的乙醇。由此可見，高含量的纖維素、半纖維素體現(xiàn)了蘆葦和滸苔具備作為乙醇生物質(zhì)原料的重要優(yōu)勢(shì)，特別是蘆葦極其具有開發(fā)利用的潛力。

圖1 不同樣品的纖維成分比較Fig.1 Comparison of fiber composition of different samples

2.2各樣品酶解液中還原糖和木糖濃度比較由圖2可知，酶解52 h，滸苔和蘆葦還原糖含量較高，分別為35.87和31.91 mg/mL。包含在還原糖中的葡萄糖等單糖在合適條件下經(jīng)普通酵母作用即可產(chǎn)生乙醇，因此利用滸苔和蘆葦酶解液中的糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇具有極大的可能性，可以將滸苔和蘆葦作為產(chǎn)乙醇生物質(zhì)原料進(jìn)行深入研究。

酶解液中還原糖主要由樣品中的纖維素和半纖維素在高溫酸化和纖維素酶的作用下產(chǎn)生。而從結(jié)果可知，樣品酸化酶解后的還原糖含量并不與樣品中纖維素、半纖維素含量成相應(yīng)的關(guān)系。如滸苔雖然半纖維素含量較高，但纖維素含量很低，產(chǎn)生的還原糖含量卻高于蘆葦和秸稈，這可能與它們各自的結(jié)構(gòu)有關(guān)。因此，在進(jìn)一步深入研究蘆葦、滸苔等作為產(chǎn)乙醇生物質(zhì)原料時(shí)，還需根據(jù)樣品的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇各自適合的預(yù)處理方法和酶解條件以提高糖產(chǎn)量。

圖2 樣品酶解液中還原糖含量比較Fig.2 Comparison of reducing sugar content in sample

由圖3可知，蘆葦酶解液中木糖含量較高為13.75 mg/mL，另3個(gè)樣品酶解液木糖含量均較低。4個(gè)樣品在酶解過程中木糖含量增長(zhǎng)較少，這可能與纖維素酶不能降解木聚糖有關(guān)。木糖是除葡萄糖外組成纖維成分的重要單體糖，由木糖形成的聚合物——木聚糖是半纖維素的重要組分，木糖通過特殊的酵母發(fā)酵也可以產(chǎn)乙醇。因此，通過比較纖維成分和酶解糖度含量，初步確定蘆葦和滸苔可作為乙醇生物質(zhì)原料，而其中的蘆葦優(yōu)勢(shì)更高。

圖3 樣品酶解液中木糖含量比較Fig.3 Comparison of xylose content in sample enzymatic hydrolysate

2.3發(fā)酵液乙醇含量根據(jù)樣品成分和酶解糖度測(cè)定結(jié)果，對(duì)蘆葦進(jìn)行初步的糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇試驗(yàn)，并與秸稈進(jìn)行比較，分別測(cè)定各自糖化液發(fā)酵20和44 h時(shí)的乙醇含量(表1)。發(fā)酵20 h時(shí)，蘆葦產(chǎn)生的乙醇含量為0.43%～0.47%，高于對(duì)照樣玉米秸稈的0.29%～0.31%，說明蘆葦可以作為產(chǎn)乙醇的原料，具有極大的開發(fā)利用價(jià)值。

表1 樣品發(fā)酵產(chǎn)乙醇含量

3 結(jié)論

纖維素、半纖維素是可發(fā)酵糖的來源，由C6糖通過釀酒酵母發(fā)酵生成乙醇是很成熟的工藝[7]。該試驗(yàn)通過對(duì)幾種海濱植物的成分分析，其中蘆葦纖維素和半纖維素含量均高于玉米秸稈，滸苔中也有較高含量的半纖維素。表明蘆葦和滸苔作為自然生長(zhǎng)的植物具有重要的研究?jī)r(jià)值。

在糖化試驗(yàn)中，蘆葦、滸苔通過酸化酶解，均產(chǎn)生較高含量的糖，在對(duì)蘆葦初步發(fā)酵產(chǎn)乙醇的試驗(yàn)中，產(chǎn)生一定含量的乙醇。試驗(yàn)表明，蘆葦、滸苔等可以作為第2代乙醇生物質(zhì)原料，特別是蘆葦具有較高研究利用的價(jià)值。

在天然木質(zhì)纖維素降解產(chǎn)乙醇的試驗(yàn)中，當(dāng)前仍然面臨諸多困難。首先，需要對(duì)生物質(zhì)原料進(jìn)行預(yù)處理，破壞其結(jié)晶結(jié)構(gòu)。預(yù)處理的效果、成本及對(duì)環(huán)境的影響是選擇不同原料預(yù)處理方法的關(guān)鍵因素。該試驗(yàn)中蘆葦纖維成分含量高，但相同酸化條件下，酶解后產(chǎn)生的糖并不高，需要通過優(yōu)化選擇合適的預(yù)處理工藝方法。目前，用于植物木質(zhì)纖維素原料預(yù)處理的方法包括：物理化學(xué)方法、液氨冷凍爆破法、超臨界CO2法和微波處理等[8]，如楊培周等[9]將超聲波法和稀H2SO4相結(jié)合進(jìn)行預(yù)處理能提高纖維素酶酶活。其次，在酶解糖化時(shí)，纖維素酶酶活低及酶解液中可能存在對(duì)酶解及發(fā)酵有抑制性的物質(zhì)等，如宋曉川等[10]研究比較幾種纖維降解產(chǎn)物對(duì)酵母發(fā)酵的毒性大小，分別為：甲酸>乙酸>糠醛>羥甲基糠醛。此外，半纖維素降解后能產(chǎn)生大量木糖，該試驗(yàn)可以看到蘆葦糖化液中也有較高含量的木糖，而當(dāng)前市售的釀酒酵母是不能利用木糖的。當(dāng)前，能同時(shí)利用木糖和葡萄糖發(fā)酵的酵母正處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，如孫博等[11]通過基因工程手段將能利用木糖的樹干畢赤酵母相關(guān)基因編碼植入釀酒酵母中，構(gòu)建能同時(shí)利用木糖和葡萄糖的酵母基因系列。因此，在利用這些海濱植物原料進(jìn)行產(chǎn)生物乙醇的試驗(yàn)仍然有待進(jìn)一步的深入研究。