戴碧純,潘碧垚,張珊珊,莊偉偉,孫紅光
(溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 精準醫(yī)學中心,浙江 溫州 325000)
核酸適配體(aptamer)是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)篩選獲得一段小ssDNA或者RNA序列。1990年,Tuerk和Gold[1]第一次從體外隨機文庫中篩選出對T4 DNA具有親和力的序列,并創(chuàng)建了指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術,并將該篩選技術稱為“SELEX”。Ellington和Szostak等[2]從隨機序列RNA文庫中分離出可特異性結合多種有機染料的RNA序列,將其命名為aptamer。簡單來講,SELEX過程包括以下幾個步驟:(1)設計、合成隨機DNA或RNA文庫;(2)與靶分子結合(通常包括正向篩選和負向篩選);(3)靶分子與結合的aptamer分離;(4)分離得到的核酸適配體經PCR擴增,得到一個富集的核酸庫;(5)經8~20輪篩選,核酸文庫富集達到飽和,對該文庫進行測序[3]。針對篩選的靶點不同,篩選技術包括有蛋白質SELEX[4],Cell-SELEX[3]等。經過SELEX技術獲得的適配體可折疊成特有的構象,如發(fā)夾結構、G-四聚體結構、環(huán)形結構等[5],可與目標靶分子特異性結合,具有良好的靶標識別能力, 可與傳統(tǒng)的抗體相媲美,又被稱為化學抗體[3]。與傳統(tǒng)抗體相比,aptamer具有分子質量較小,靶標廣泛,免疫原性低或無免疫原性,生產成本低,易于化學修飾等優(yōu)點。
胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma,PAC)是一種惡性程度很高、診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤,約90%為起源于腺管上皮的導管腺癌。胰腺癌缺乏特異性的體征和癥狀,近年來其發(fā)病率和死亡率明顯上升,或將超過乳腺癌、前列腺癌和直腸癌,成為繼肺癌之后的第二大癌癥[6],胰腺癌的手術切除率較低,5年生存率約為5%[7]。目前臨床上胰腺癌的早期篩查手段主要包括B超、CT、磁共振胰膽管成像(MRCP)、超聲內鏡(EUS)和經內鏡逆行胰膽管造影(ERCP)等。CT 是胰腺成像檢查的首選方式,也是術后評估胰腺癌復發(fā)的首選方法。然而CT診斷的敏感度隨腫瘤直徑的縮小而降低,且檢查費用較高,限制了其作為無癥狀高風險人群的常規(guī)篩查項目[8]。血清腫瘤標志物的檢查具有易于收集、創(chuàng)傷小、經濟便捷等優(yōu)點,目前臨床上最常用的胰腺癌早期篩查的腫瘤標志物是血清糖抗原(CA19-9),其診斷胰腺癌的總體敏感度79%~81%,特異度80%~90%,但其陽性多見于進展期胰腺癌,對早期小胰腺癌的診斷效能低[9]。由于CA19-9在部分非惡性患者中會出現(xiàn)假陽性,如急慢性胰腺炎、梗阻性黃疸、肝硬化及胃腸道腫瘤,故主要用于判斷胰腺癌分期、手術切除效率及檢測術后復發(fā)[10]。目前認為單獨檢測CA19-9并不適用于早期胰腺癌尤其是小胰腺癌的檢測及其與良性疾病的鑒別[11]。因此,提高胰腺癌的早期診斷率以及開發(fā)有效的PAC靶向治療方法具有重要意義。
癌癥干細胞(CSCs)具有腫瘤誘導能力,與腫瘤轉移,復發(fā)和化療/放射抗性有一定的相關性[12]。因此,對CSCs的鑒定可能對胰腺癌的早期診斷有重要意義。Kim和Song[13]研究了胰腺CSCs相關適配體作為診斷和治療藥物的新工具。通過改良Cell-SELEX方法,篩選與胰腺癌中癌癥干細胞結合的適配體。通過HPAC(胰腺癌細胞系)產生的tumor sphere進行正篩選,然后通過HPDEC(胰腺正常細胞系)進行負篩選。篩選出高特異性的適配體aptamer 1和aptamer 146,其KD值(平衡解離常數(shù))分別為22.8 nmol/L和22.62 nmol/L。通過FACS(流式細胞熒光分選技術)分析與適配體陰性細胞相比,適配體陽性細胞顯示出高表達水平的CSCs相關基因。通過共聚焦顯微鏡在適配體陽性細胞中也觀察到CD44、CD24、ESA和CD133的共定位。在Kim和Song的研究中,這兩種胰腺CSCs相關適配體可作為是新的腫瘤診斷標志物、CSCs靶向藥物遞送或循環(huán)腫瘤細胞檢測的潛在候選者。
Dua P和Lee DK[14]基于Cell-SELEX篩選出核酸適配體aptamer SQ2,與胰腺癌細胞表達的ALPPL2(胎盤堿性磷酸酶蛋白)特異性結合。經修飾后,截短形式的適配體SQ2的長度為25個核苷酸,KD值為20 nmol/L,在5’和3’兩端進行修飾或結合藥物后不影響其靶向結合能力。實驗證實aptamer SQ2可以通過網(wǎng)格蛋白運輸或其他細胞內吞途徑內化到胰腺癌細胞中,經化學修飾后可以用于靶向遞送治療性分子。Dua P和Lee DK[14]通過實驗證實aptamer SQ2可以成功地將抗癌核苷類藥物5F-dU(5-氟-2’-脫氧尿苷)遞送至表達ALPPL2的胰腺癌細胞中,但對正常胰腺導管細胞沒有細胞毒性。
吉西他濱(Gemcitabine)為一種新的胞嘧啶核苷衍生物,進入人體內后由脫氧胞嘧啶激酶活化,由胞嘧啶核苷脫氨酶代謝,是嘧啶類抗腫瘤藥物。其作用機制和阿糖胞苷相同,主要作用于G1/S期,抑制核苷酸還原酶,導致細胞內脫氧核苷三磷酸酯減少,可抑制脫氧胞嘧啶脫氨酶,減少細胞內代謝物的降解,具有自我增效的作用。吉西他濱目前被認為是治療胰腺癌的一線化療藥物,具有分子量小,親水性高等優(yōu)點,同時也存在反應效率低,易被胞苷脫氨酶降解,細胞滲透性差等缺點。
AS1411是一種富含鳥嘌呤核苷酸的DNA適配體,可以形成G-四鏈體這一獨特的結構,使得結構相對于其他適配體相對穩(wěn)定。aptamer-AS1411已被證明對許多癌癥具有抗癌作用。核仁素(nucleolin)是一種細胞質膜蛋白,通常過表達于PAC等多種腫瘤細胞膜及其細胞質中[15],AS1411可與核仁素特異性結合,高劑量AS1411與核仁素結合可以抑制NF-κB信號通路,導致細胞周期停滯和細胞凋亡[16]。因此,Bates[17]開始對AS1411進行一些臨床研究。然而,AS1411的II期臨床試驗結果不足以成為一線治療藥物。
Park等[18]研究了適配體-藥物偶聯(lián)物(ApDCs),以試圖克服它們的細胞滲透性差,非特異性毒性等缺點,與抗體偶聯(lián)藥物相比,ApDCs在偶聯(lián)、制劑等方面比抗體有優(yōu)勢。Ray等[19]首次報道了將吉西他濱摻入寡核苷酸的概念,通過突變RNA聚合酶將吉西他濱摻入寡核苷酸中,并將含吉西他濱的寡核苷酸進行靶向藥物遞送。Park等[18]開發(fā)了一種摻入吉西他濱的AS1411,即APTA-12。吉西他濱是一類可以摻入寡核苷酸的核苷脫氧胞苷類似物,AS1411可形成穩(wěn)定的G-四鏈體結構,內部莖環(huán)結構位于12-15個核苷酸之間(序列為5’-GGTGGTGGTGGTTGTGG TGGTGGTGG-3’)。通過用吉西他濱亞磷酰胺單獨取代AS1411序列14位的鳥嘌呤殘基,產生了APTA-12適配體。APTA-12適配體的序列是5’-GGTGGTGGTG GTTZTGGTGGTGGTGG-3’(Z,吉西他濱)。Park將吉西他濱摻入AS1411適配體的莖環(huán)區(qū)域,以避免改變三級結構并保護其免受核酸酶的快速降解。實驗測定了APTA-12和AS1411的KD值,分別為(14.37±8.93)nmol/L,和(16.36±10.30)nmol/L。該結果證明AS1411序列的環(huán)區(qū)域的吉西他濱修飾不改變結合親和力,并且化學修飾的APTA-12保留了比AS1411適配體對核仁蛋白稍高的結合親和力。
APTA-12在Capan-1,AsPC-1和MIA PaCa-2細胞的共聚焦實驗中,選擇性地結合到細胞表面,疊層成像顯示內化的APTA-12適配體僅在核仁蛋白陽性細胞中積累。而流式細胞術分析表明APTA-12適配體與核仁蛋白的親和力比AS1411更高。此外,APTA-12處理胰腺癌細胞后顯著降低細胞增殖,APTA-12處理細胞的IC50(半抑制濃度)值遠低于AS1411。體內評價顯示APTA-12可有效抑制裸鼠胰腺癌細胞的生長。與AS1411處理的小鼠相比,APTA-12處理的小鼠的腫瘤區(qū)域中的FDG SUV降低了78%,治療組之間體重沒有明顯差異。TUNEL檢測和Ki67測定顯示,與對照組相比,APTA-12能夠誘導更多的凋亡細胞死亡并減少增殖的腫瘤細胞的數(shù)量。實驗結果證明摻入吉西他濱的APTA-12的具有抗腫瘤的功效。
Yoon等[20]合成了吉西他濱摻入5-氟尿嘧啶的RNA適配體,并證實了它可被內化并抑制了胰腺癌細胞的增殖。將溶瘤核苷類似物內在地摻入適配體被證實可能是開發(fā)ApDCs的良好策略,因為其易于化學修飾同時不損失親和力,便于大規(guī)?;瘜W合成,在體內比單獨的藥物具有更高的治療效果,是目前比較有前景的一種抗癌策略。
胰腺癌由于其腫瘤基質中細胞外基質(ECM)的異常表達,形成緊密的物理屏障,導致細胞毒性化學治療劑難以遞送至腫瘤細胞中[21]。盡管已經開發(fā)了納米藥物,例如脂質體、聚合物納米顆粒和膠束,以增強化學抗癌劑的滲透性[22],但治療效果仍不理想。HE[23]基于適配體GBI-10設計了具有腫瘤穿透和智能藥物釋放曲線的Apt/CPP-CPTD NP(適配體/細胞穿透肽-喜樹堿前藥)。GBI-10適配體靶向ECM,被修飾到可滲透細胞的穿透肽(CPP)上,用于體內CPP偽裝和PDAC歸巢,增強了PDAC靶向藥物遞送,并且降低了藥物的全身毒性。
核酸適配體的發(fā)展為腫瘤的診斷和腫瘤靶向治療提供了一種新的方法,與現(xiàn)有的血清學腫瘤標志物檢查相比,針對胰腺腫瘤標志物篩選出的核酸適配體兼具敏感性和特異性,再結合影像學檢查結果,對提高胰腺癌早期診斷有一定的幫助。核酸適配體具有良好的組織穿透能力,易被細胞內化,與胰腺癌治療藥物偶聯(lián)可靶向腫瘤特定位點,起到靶向治療的作用,降低一些化學藥物的全身毒性。靶向PAC 細胞的適配體還可以被開發(fā)成傳感器,用于快速、高效和更加靈敏地檢測PAC。
但核酸適配體還存在著一些問題:(1)適配體在體內穩(wěn)定性較差,體外篩選得到的適配體在體內易被核酸酶降解[24];(2)適配體相對分子質量小,易被腎臟快速過濾。由于這些缺點,限制了核酸適配體在PAC的臨床應用。為了推動適配體在PAC臨床應用的發(fā)展,主要可從以下幾個方面來解決上述問題:(1)通過化學修飾,添加2’-氟、2’-氨基、或2’-O-甲氧[25],提高核酸適配體的核酸酶抗性;(2)篩選具有穩(wěn)定結構的適配體,如G-四聚體以提高生理環(huán)境中的核酸適配體的穩(wěn)定性;(3)與大分子生物材料偶聯(lián)可以解決核酸適配體易被腎臟過濾清除的問題,如偶聯(lián)納米材料[26]。上述修飾或改構方法均可顯著提高核酸適配體在體內應用的有效性,隨著研究的深入,核酸適配體有望應用于胰腺癌早期診斷和/或靶向治療,為這一難治性腫瘤的臨床診斷和治療提供新的思路。