魯 立，于建釗，解 鑫，許秀艷

1.貴陽市環(huán)境監(jiān)測中心站，貴州 貴陽 550002 2.中國環(huán)境監(jiān)測總站，國家環(huán)境保護(hù)環(huán)境監(jiān)測質(zhì)量控制重點實驗室，北京 100012

作為一種劇毒元素，因其毒性與其在環(huán)境中的化學(xué)形態(tài)密切相關(guān)，汞的化學(xué)形態(tài)分析日益受到關(guān)注。汞在環(huán)境中主要以元素汞、無機(jī)汞和有機(jī)汞的方式存在。有機(jī)汞的毒性遠(yuǎn)大于元素汞和無機(jī)汞，有機(jī)汞主要有甲基汞、乙基汞和苯基汞等。甲基汞是毒性最大的有機(jī)汞，易于穿透生物膜且通過食物鏈聚集[1-5]。人體血液中甲基汞的質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過0.2 μg/g時就會出現(xiàn)中毒癥狀。與甲基汞不同，乙基汞并沒有發(fā)現(xiàn)具有生物累積性。乙基汞屬親脂性毒物，乙基汞中毒以神經(jīng)系統(tǒng)和心臟損害較為突出。

人為排放和自然排放的汞可以通過各種途徑進(jìn)入環(huán)境，并經(jīng)過各種循環(huán)最終進(jìn)入土壤和沉積物。此外，土壤中的微生物還可以將無機(jī)汞轉(zhuǎn)化為毒性更大的甲基汞，從而增加汞的毒性和生物可利用性[6-7]。因此，對土壤中烷基汞含量的分析測定非常重要。

烷基汞的分析測試方法方面，我國僅有《環(huán)境甲基汞的測定氣相色譜法》(GB/T 17132—1997)和《水質(zhì)烷基汞的測定氣相色譜法》(GB/T 17204—93)2個相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)方法，這2個方法都存在選擇性不佳及靈敏度較低的問題。美國《Methyl Mercury in Wacter by Distillation, Aqueous Ethylation, Pulge and Trap, and CVAFS》(EPA 1630)用于水樣中甲基汞的分析，是目前受到廣泛認(rèn)可和應(yīng)用的汞形態(tài)分析方法，其原理為含有甲基汞的水樣經(jīng)蒸餾、乙基衍生化和吹掃捕集等處理后，轉(zhuǎn)化為元素汞后通過冷原子熒光光譜測定[8]。目前，文獻(xiàn)關(guān)于烷基汞的報道[9-11]也多集中在水體中甲基汞的測定方法研究。

相對水體樣品，土壤樣品基質(zhì)復(fù)雜，烷基汞的含量較低。準(zhǔn)確測定土壤中烷基汞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于樣品提取過程，在提取過程中既要保證樣品中汞化合物的原來形態(tài)不發(fā)生破壞和轉(zhuǎn)化，又要保證烷基汞從樣品中被充分提取以達(dá)到穩(wěn)定可靠的回收效果。目前提取土壤中甲基汞的有效方法主要包括酸浸提和堿提取[12-15]。酸浸提法相比堿提取法操作步驟繁瑣，而且當(dāng)樣品中含有大量有機(jī)物質(zhì)時，用酸-有機(jī)溶劑萃取會發(fā)生嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象，產(chǎn)生大量的泡沫，增加了萃取時間和萃取難度。堿提取法操作簡便，實用性強，非常適用于環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域批量樣品的分析。

本研究建立了堿提取-丙基化衍生法同時測定土壤中甲基汞和乙基汞的方法，并對樣品的前處理條件和儀器測定方法進(jìn)行了深入探討。該法操作簡單，靈敏度高，為土壤中甲機(jī)汞和乙基汞的測定提供了方法依據(jù)，同時也可為土壤污染調(diào)查及風(fēng)險評估工作提供重要的技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與條件

吹掃捕集/氣相色譜-原子熒光光譜儀(美國)，Milli-Q純水凈化儀(德國)，渦旋振蕩器(日本)，振蕩水浴搖床(日本)，分析天平(精度為0.001 g，中國)，尼龍樣品篩(篩孔粒徑0.150 mm)。

吹掃捕集氣為氬氣，吹掃捕集氣流速394 mL/min，干燥氣為氬氣，干燥氣流速為297 mL/min，吹掃捕集時間5 min，加熱解析時間9.9 s，捕集管干燥時間3 min，氣相色譜柱溫度46 ℃，氣相色譜載氣為氬氣，氣相色譜載氣流速22 mL/min。

1.2 試劑

甲基汞沉積物標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)ERM-CC580(歐洲)，甲醇(色譜純，德國)，氫氧化鉀(優(yōu)級純，美國)，醋酸鈉(優(yōu)級純，中國)，冰醋酸(分析純，中國)，四丙基硼化鈉(99%，美國)，氯化甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/L，美國)，氯化乙基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/L，美國)。

2 mol/L醋酸緩沖溶液：稱取27.2 g醋酸鈉和11.8 mL冰醋酸溶于實驗用水中，定容至100 mL。

25%氫氧化鉀甲醇溶液：稱量50.00 g氫氧化鉀至200 mL甲醇中，蓋緊蓋子，超聲溶解20 min至溶液為乳白色即可。

1%四丙基硼化鈉溶液：稱量0.80 g氫氧化鉀至40 mL棕色樣品瓶中，然后移取40 mL實驗用水加入瓶中，加蓋混勻，放入冰箱冷卻至0 ℃(直至出現(xiàn)冰晶)后，加0.4 g四丙基硼化鈉，搖勻后迅速將上述溶液分裝至色譜進(jìn)樣小瓶中，上蓋旋緊，搖勻。-20 ℃冷凍條件保存。隨取隨用，不可在常溫下久置。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在5個40 mL棕色樣品瓶中分別加入實驗用水約35 mL至瓶頸處，使用烷基汞標(biāo)準(zhǔn)使用液配制2、10、50、250、500 pg的標(biāo)準(zhǔn)系列(可根據(jù)樣品的實際情況適當(dāng)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)系列)，依次加入300 μL醋酸-醋酸鈉緩沖液及50 μL 1%四丙基硼化鈉水溶液后迅速加入實驗用水至瓶滿，蓋緊蓋子搖勻并靜置10～15 min后放入自動進(jìn)樣器進(jìn)行測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，以烷基汞質(zhì)量(pg)為橫坐標(biāo)，用最小二乘法計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，繪制甲基汞和乙基汞的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 實驗方法

稱取0.100～0.150 g土壤樣品于50 mL聚丙烯管中，加入2.5 mL 25%KOH甲醇溶液后渦旋混勻。蓋緊蓋子，置入70 ℃水浴搖床中，振蕩提取3 h。取出樣品置于通風(fēng)櫥靜置冷卻至室溫后，開蓋加入8.0 mL實驗用水，蓋緊蓋子，渦旋混勻，此時管內(nèi)液體體積為10.5 mL。靜置，使管內(nèi)固體物沉降完全，上清液盡量澄清。

于40 mL棕色樣品瓶中加入實驗用水約35 mL至瓶頸處，吸取經(jīng)堿提取后的150 μL試樣上清液至樣品瓶，然后依次加入300 μL醋酸緩沖液及50 μL 1%四丙基硼化鈉水溶液，最后迅速加入實驗用水至瓶滿，蓋緊蓋子搖勻并靜置10～15 min。在與繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的條件下，測定試樣和空白試樣提取液中烷基汞的含量，以保留時間定性，由甲基汞和乙基汞的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到甲基汞和乙基汞的質(zhì)量(pg)。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

在進(jìn)行氣相色譜分析時，色譜柱的選擇至關(guān)重要。常見的市售毛細(xì)管色譜柱如DB-1、DB-5MS、 DB-17均可被用來分離甲基汞、乙基汞和Hg2+的衍生化產(chǎn)物。填充柱方面，普通OV-3柱只能有效分離Hg0和甲基丙基汞。改性O(shè)V-3柱可以實現(xiàn)Hg0、甲基丙基汞、乙基丙基汞、二丙基化汞的有效分離(圖1)?？紤]到所用儀器接口情況，本實驗中選用OV-3填充柱(改性)，實現(xiàn)目標(biāo)化合物的分離。

圖1 色譜柱對目標(biāo)物分離效果的影響Fig.1 Effect of chromatographic column on the separation of Hg0, methyl propyl mercury, ethyl propyl mercury and two propyl mercury

2.1.2 載氣的影響

本研究考察了2種常用載氣對烷基汞分析的影響，如圖2所示。采用氬氣作為載氣時，目標(biāo)物的響應(yīng)值明顯高于以氮氣作為載氣時的響應(yīng)值。因此選用氬氣作為載氣。

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 衍生化試劑及衍生化反應(yīng)

四乙基硼化鈉、四丙基硼化鈉和四苯基硼化鈉是最常用的汞烷基化試劑[16-17]。如果采用四乙基硼化鈉作為烷基化試劑，土壤中二價汞和乙基汞衍生化產(chǎn)物同為乙基乙基汞，容易造成假陽性。由于本研究同時測定甲基汞和乙基汞，可以選用四丙基硼化鈉或者四苯基硼化鈉作為衍生化試劑。但四苯基硼化鈉作為衍生試劑時的衍生產(chǎn)物的沸點高，揮發(fā)性較差，不適宜采用氣相色譜進(jìn)行分離。因此，最終選取四丙基硼化鈉作為衍生化試劑。

圖2 載氣種類對目標(biāo)物測定靈敏度的影響Fig.2 Influence of carrier gas on the sensitivity of Hg0, methyl propyl mercury, ethyl propyl mercury and two propyl mercury

二價汞、甲基汞和乙基汞在四丙基硼化鈉的衍生下，分別生成丙基丙基汞、甲基丙基汞和乙基丙基汞，見式(1)～式(3)。

CH3Hg++NaB(C3H7)4→CH3-Hg-C3H7+

B(C3H7)3+Na+

(1)

C2H5Hg++NaB(C3H7)4→C2H5-Hg-C3H7+

B(C3H7)3+Na+

(2)

Hg2++2NaB(C3H7)4→Hg(C3H7)2+

2B(C3H7)3+2Na+

(3)

2.2.2 pH對衍生化反應(yīng)的影響

衍生化反應(yīng)過程與pH密切相關(guān)。圖3給出了甲基汞和乙基汞在pH 3～7之間的丙基化衍生效果。由圖3可以看出，甲基汞和乙基汞在pH 4～6范圍丙基化衍生效率較高。

穩(wěn)定調(diào)節(jié)丙基化衍生反應(yīng)水相體系的pH，添加一定體積的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液是行之有效的方式?？疾炝思谆鸵一|(zhì)量均為100 pg時，衍生反應(yīng)水相體系pH隨緩沖液加入量的變化情況。研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)不添加緩沖溶液時，衍生反應(yīng)水相體系pH為11.45；當(dāng)緩沖液加入量為100 μL時，衍生反應(yīng)水相體系pH降至6.03；當(dāng)緩沖溶液加入量為300 μL時，衍生反應(yīng)水相體系pH為5.03；繼續(xù)加大緩沖液加入量，衍生反應(yīng)水相體系pH已趨于穩(wěn)定，而緩沖溶液本身pH為4.65，說明當(dāng)緩沖溶液加入量為300 μL時已達(dá)到衍生反應(yīng)水相體系的最佳pH條件。圖4甲基汞和乙基汞的回收率隨緩沖液加入量的變化曲線也進(jìn)一步證實了該結(jié)論。

圖3 pH對烷基汞丙基化衍生化反應(yīng)效率的影響Fig.3 Effect of pH on the efficiency of alkylation reaction of alkyl mercury

圖4 甲基汞和乙基汞的回收率隨緩沖液加入量的變化曲線Fig.4 The curves of the recovery of methylmercury and ethyl mercury with the addition of buffer

2.2.3 衍生化試劑加入量優(yōu)化

四丙基硼化鈉的加入量直接影響衍生化反應(yīng)效率，加入量過少，衍生化反應(yīng)不完全，加入量過多，衍生化反應(yīng)過快容易導(dǎo)致衍生產(chǎn)物揮發(fā)損失。圖5給出了水相中甲基汞和乙基汞質(zhì)量分別為1 000 pg時，烷基汞丙基化衍生產(chǎn)物回收率與四丙基硼化鈉加入量的關(guān)系曲線。由圖5可以看出，當(dāng)四丙基硼化鈉的加入量為30～90 μL時，衍生化效果無顯著差異。綜合考慮衍生化試劑的穩(wěn)定性和土壤基體的復(fù)雜性，本研究確定四丙基硼化鈉的加入量為50 μL。

圖5 衍生化試劑加入量對烷基汞衍生化效果的影響Fig.5 Effect of the amount of derivatization reagent on the derivatization of alkyl mercury

2.2.4 提取溫度和提取時間的確定

提取溫度和提取時間是堿提取前處理的關(guān)鍵參數(shù)，直接影響土壤中烷基汞的提取效率。分別稱取0.100～0.150 g ERM-CC580于50 mL聚丙烯管中，添加7 000 pg乙基汞標(biāo)液后加蓋漩渦混勻，開蓋后加入2.5 mL 25% KOH甲醇溶液，再次加蓋渦旋混勻。分別置入50、60、70、80、90 ℃水浴搖床中振蕩，控制每個提取溫度下提取時間分別為1、2、3、4、5 h時將提取樣品取出，然后按照實驗方法完成后續(xù)操作。實驗中發(fā)現(xiàn)，90 ℃條件下，聚丙烯管蓋子容易受熱斷裂，直接影響后續(xù)實驗結(jié)果，因此只考察了50～80 ℃提取溫度下甲基汞和乙基汞的回收率隨提取時間延長的變化趨勢，詳見圖6。綜合考慮提取條件下甲基汞和乙基汞的回收率結(jié)果，最終確定的提取溫度為70 ℃，提取時間為3 h。

2.3 方法評價

按照《環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》(HJ 168—2010)的相關(guān)規(guī)定，重復(fù)分析9個接近于檢出限濃度的空白加標(biāo)樣品，通過計算，甲基汞和乙基汞的方法檢出限分別為0.5 μg/kg和0.3 μg/kg。標(biāo)準(zhǔn)曲線在2～500 pg范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)大于0.999，線性良好。

平行測定CC580沉積物樣品(75 μg/kg)9次，平均回收率為85.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.9%。

2.4 實際樣品分析結(jié)果

選取具有代表性的5種土壤樣品，分別為遼寧棕壤土、河南黃潮土、四川紫色土、江西紅壤土和黑龍江黑土，測得所有土樣中均不含有甲基汞和乙基汞。對實際樣品進(jìn)行低、中、高加標(biāo)測定，每個樣品平行處理8份?？疾旒谆鸵一木芏扰c準(zhǔn)確度，結(jié)果詳見表1。由表1可以看出，甲基汞和乙基汞的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.3%～17%和0.94%～16%，甲基汞和乙基汞的平均回收率分別為88.2%～110%和66.1%～110%。

圖6 甲基汞和乙基汞的回收率隨提取溫度和提取時間的變化趨勢Fig.6 The change trend of recovery rate of methylmercury and ethyl mercury with extraction temperature and extraction time

表1 土壤樣品的加標(biāo)結(jié)果Table 1 Spike results of soil samples %

3 結(jié)論

應(yīng)用堿提取-丙基化衍生法同時測定土壤中甲基汞和乙基汞，兩者的方法檢出限分別為0.5 μg/kg和0.3 μg/kg。應(yīng)用于實際土壤樣品分析，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.3%～17%和0.94%～16%，平均回收率分別為88.2%～110%和66.1%～110%。該法操作簡單，靈敏度高，適用于批量土壤中甲基汞和乙基汞的分析。