謝南昌,余夢(mèng)嫣,王 翠,李英嬌,孟祥荷,連亞軍

阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種進(jìn)展性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,以記憶力下降、認(rèn)知功能障礙為主要臨床特征[1]。細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)沉積形成神經(jīng)炎性斑(neuritic plaques,NP)是AD主要病理特點(diǎn),指Aβ沉積周圍出現(xiàn)大量反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞。生理狀態(tài)下,小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜止期,在AD等神經(jīng)退行性疾病中,小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生活化并吞噬清除β-淀粉樣蛋白,但過(guò)度活化或凋亡導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α、NO等)釋放,從而導(dǎo)致神經(jīng)毒性或一系列不可控炎癥反應(yīng)[2]。因此在AD治療靶向目標(biāo)上,越來(lái)越多的目光移向小膠質(zhì)細(xì)胞。

研究證明[3,4]活化的小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮吞噬作用或促炎癥因子的釋放等功能均是鈣離子依賴性的。最近鑒定出的鈣離子單向轉(zhuǎn)運(yùn)體(mitochondrial calcium uniporter,MCU)是一種位于線粒體內(nèi)膜上介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流的選擇性鈣通道,在細(xì)胞和線粒體鈣離子濃度調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]。以往研究[6,7]證實(shí)ER-線粒體串話參與Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡,且線粒體功能損傷增強(qiáng)了Aβ誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。ERS時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(glucose regulating protein 78,GRP78)首先與3種跨膜蛋白解離而被激活,啟動(dòng)ERS生存途徑。ERS過(guò)度時(shí),則啟動(dòng)ERS凋亡途徑,相關(guān)凋亡分子CHOP(C/EBP homologous protein,CHOP)和caspase-12上調(diào)表達(dá)。最近研究[8,9]發(fā)現(xiàn)MCU在心肌損傷及腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用,但MCU在Aβ誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡中的作用仍未闡明。

本研究中,我們采用MCU抑制劑Ru360[10]和激動(dòng)劑Spermine[11]來(lái)研究MCU在Aβ誘導(dǎo)體外原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制。并進(jìn)一步采用線粒體特異性抗氧化劑MitoQ來(lái)明確線粒體氧化應(yīng)激與ERS之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM 培養(yǎng)基、FBS(購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司)；Ru360(購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司)；Spermine、Aβ25-35(購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司)；MitoQ(購(gòu)自新西蘭MedChemExpress公司)；Rhod-2/AM(購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司)；蓖麻凝集素-1(ricinus commol/Lunis agglutinin-1,RCA-1)抗體(購(gòu)自美國(guó) Vector 公司)；MitoSOX 熒光探針(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)；GRP78、CHOP、caspase-12抗體(購(gòu)自美國(guó)CST公司)；β-actin(購(gòu)自武漢三鷹公司)；Annexin V-FITC/PI 雙染凋亡檢測(cè)試劑盒、全蛋白提取試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 原代小膠質(zhì)細(xì)胞的制備與分組 取BALB/C新生小鼠(購(gòu)自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心),無(wú)菌條件下分離出雙側(cè)大腦皮質(zhì),剪成小塊,用0.125%胰蛋白酶溶液在37 ℃恒溫水浴消化20 min后加入培養(yǎng)液以終止消化。用滴管反復(fù)吹打成細(xì)胞懸液,200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾,過(guò)濾液以1000 r/min離心,棄上清,加入培養(yǎng)液重懸。然后接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至第10～14天時(shí),用搖床固定以180 rpm震蕩2 h,將振搖下來(lái)的小膠質(zhì)細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。小膠質(zhì)細(xì)胞純度通過(guò)RCA-1染色驗(yàn)證>95%。將純化的小膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為5組,分別是對(duì)照組、Aβ25-35組、Ru360組、Spermine組、MitoQ組。對(duì)照組未特殊處理。Aβ25-35組用20 μmol/L Aβ25-35處理小膠質(zhì)細(xì)胞24 h。Ru360組和Spermine組分別用5 μmol/L Ru360和10 μmol/L Spermine預(yù)處理原代小膠質(zhì)細(xì)胞1 h,然后二者均用20 μmol/L Aβ25-35處理24 h。MitoQ組先用0.1 μmol/L MitoQ處理6 h,再20 μmol/L Aβ25-35處理24 h。實(shí)驗(yàn)程序經(jīng)鄭州大學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范嚴(yán)格參照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 Aβ25-35聚合物的制備 使用HFIP溶解至1 mmol/L,在生物安全柜中蒸發(fā)去除HFIP形成肽膜。-80 ℃保存。使用時(shí)將肽膜溶于無(wú)水DMSO中至5 mmol/L(儲(chǔ)備溶液)。使用時(shí)用冷PBS將溶液稀釋至100 μmol/L,4 ℃孵育24 h,并在4 ℃以14,000 g離心10 min,將含有可溶性Aβ25-35寡聚體的上清液轉(zhuǎn)移至干凈的試管中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 線粒體鈣離子濃度測(cè)定 首先用HEPES 緩沖液沖洗原代小膠質(zhì)細(xì)胞,然后用含有11 μmol/L鈣離子熒光探針Rhod-2/AM的HEPES緩沖液在低溫下孵育15 min。使用分光光度計(jì)在575 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和605 nm的發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)量熒光。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 先收集細(xì)胞并用冰冷的PBS洗滌兩次,于200 μl結(jié)合緩沖液懸浮培養(yǎng)。 細(xì)胞重懸后,每個(gè)樣品中各加入5 μl 膜聯(lián)蛋白V-FITC和5 μl碘化丙錠。然后在室溫下在黑暗中孵育10 min。在FACScan流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.2.5 線粒體ROS生成水平檢測(cè) 使用線粒體熒光探針MitoSOX評(píng)估線粒體ROS生成水平。用5 μmol/L MitoSOX工作液37 ℃避光孵育胰蛋白酶已處理過(guò)的原代小膠質(zhì)細(xì)胞15 min,PBS清洗,然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析ROS生成水平,結(jié)果以各單位的熒光強(qiáng)度表示。

1.2.6 Western blotting分析 通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離30 μg蛋白質(zhì),然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下膜在5%脫脂奶粉組成的封閉溶液中封閉2 h。 然后用一抗GRP78(1∶1000)、CHOP(1∶1000)和caspase-12(1∶1000)抗體在4 ℃過(guò)夜孵育膜,內(nèi)參為β-actin蛋白,用抗β-actin抗體(1∶2000)檢測(cè))。1×TBST溶液清洗3次,每次10 min。二抗中室溫下孵育1 h,再1×TBST溶液清洗3次,每次10 min。用ECL化學(xué)發(fā)光液曝光,使用分光密度計(jì)的光密度分析來(lái)量化條帶強(qiáng)度。

2 結(jié) 果

2.1 MCU對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)原代小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的作用 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞發(fā)現(xiàn),和對(duì)照組相比,Aβ25-35組細(xì)胞凋亡明顯增多(P<0.05)；與Aβ25-35組相比,Ru360組小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡明顯減少,而Spermine組小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡明顯增多(P<0.05)(見(jiàn)圖1)。

2.2 MCU對(duì)線粒體鈣離子濃度和線粒體ROS生成水平的作用 與對(duì)照組相比,Aβ25-35組原代小膠質(zhì)細(xì)胞線粒體鈣離子濃度和線粒體ROS生成水平明顯增加升高(P<0.05)；與Aβ25-35組相比,Ru360組線粒體鈣離子濃度和線粒體ROS生成水平明顯降低,而Spermine組線粒體鈣離子濃度和線粒體ROS生成水平明顯升高(P<0.05)(見(jiàn)圖2)。

2.3 MCU對(duì)GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表達(dá)影響

2.4 MitoQ對(duì)ERS的激活作用 與對(duì)照組相比,Aβ25-35組原代小膠質(zhì)細(xì)胞GRP78、CHOP和caspase-12的表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)；與Aβ25-35組相比,Ru360減少了GRP78、CHOP和caspase-12表達(dá)水平的升高,而Spermine增加了GRP78、CHOP和caspase-12表達(dá)水平的升高(P<0.05)(見(jiàn)圖3)。與Aβ25-35組相比,MitoQ明顯降低了線粒體ROS生成水平,并且MitoQ預(yù)處理可降低GRP78、CHOP和caspase-12表達(dá)(見(jiàn)圖4)。

與對(duì)照組比較*P<0.05；與Aβ25-35組比較#P<0.05(各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次)

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)正常對(duì)照組、Aβ25-35組、Aβ25-35+Ru360組、Aβ25-35+Spermine組細(xì)胞凋亡

A：與對(duì)照組比較*P<0.05；與Aβ25-35組比較#P<0.05。B:與對(duì)照組比較*P<0.05；與Aβ25-35組比較#P<0.05(各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次)

圖2 A:Ru360和Spermine對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞線粒體鈣離子濃度的影響;B:Ru360和Spermine對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞線粒體ROS生成的影響

與對(duì)照組比較*P<0.05；與Aβ25-35組比較#P<0.05 (各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次)

圖3 Ru360和Spermine對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白CHOP、GRP78、caspase-12表達(dá)的影響

A：與對(duì)照組比較*P<0.05；與Aβ25-35 組比較#P<0.05。B：與對(duì)照組比較*P<0.05；與Aβ25-35組比較#P<0.05(各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次)

圖4 A:MitoQ對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞線粒體ROS生成水平的影響;B:MitoQ對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白CHOP、GRP78和caspase-12表達(dá)的影響

3 討 論

本研究中,我們證實(shí)了MCU在Aβ25-35誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用,發(fā)現(xiàn)抑制MCU可通過(guò)緩解線粒體鈣超載、氧化應(yīng)激及ERS對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,而激活MCU發(fā)揮相反作用。且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)采用線粒體特異性抗氧化劑MitoQ干預(yù)緩解了ERS,表明線粒體氧化應(yīng)激介導(dǎo)了Aβ25-35誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞ERS的激活。

MCU是鈣離子進(jìn)入線粒體的重要通道,當(dāng)線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間形成瞬間高濃度Ca2+微區(qū)[12]或結(jié)合激動(dòng)劑Spermine時(shí),MCU開(kāi)放從而導(dǎo)致線粒體鈣離子濃度升高。生理狀態(tài)下,線粒體基質(zhì)可代償增多的鈣離子,但線粒體鈣超載會(huì)導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)開(kāi)放,并可刺激ROS生成,引起線粒體膜電位降低,細(xì)胞色素C釋放,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激是神經(jīng)退行性疾病如AD的發(fā)病機(jī)制之一[13,14],其在Aβ介導(dǎo)的神經(jīng)毒性過(guò)程中起著重要作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)Aβ25-35誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞線粒體Ca2+濃度和ROS生成水平升高,而MCU抑制劑逆轉(zhuǎn)了線粒體鈣超載和氧化應(yīng)激。以往研究發(fā)現(xiàn)Spermine可增強(qiáng)缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激,并且MCU抑制劑可降低因腦和心臟細(xì)胞中的鐵超載引起的ROS產(chǎn)生[16～19],這些發(fā)現(xiàn)與本研究結(jié)果一致。

ERS時(shí),GRP78表達(dá)上調(diào)促進(jìn)蛋白正確折疊、協(xié)助錯(cuò)誤折疊蛋白的轉(zhuǎn)移以恢復(fù)ER穩(wěn)態(tài),但過(guò)度或持續(xù)的ERS可激活CHOP、caspase-12和JNK通路誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡。CHOP可通過(guò)上調(diào)促凋亡基因Bax/Bak、下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2促進(jìn)細(xì)胞凋亡[20],而caspase-12活化后激活caspase-9、caspase-3從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。以往研究[6,7]證實(shí)線粒體-ER串話參與Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡,本研究發(fā)現(xiàn)Aβ25-35誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、CHOP和caspase-12表達(dá)增加,提示Aβ25-35激活小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MCU抑制劑顯著降低GRP78、CHOP和caspase-12表達(dá)并減少小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡,而Spermine增加GRP78、CHOP和caspase-12表達(dá)并增加小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡,表明MCU調(diào)控的ERS在Aβ誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。

許多病理狀態(tài)下,氧化應(yīng)激與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān),氧化應(yīng)激可以破壞ER功能,并誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[21,22]。MitoQ是目前線粒體靶向抗氧化劑中最具代表性的。本研究發(fā)現(xiàn)MitoQ抑制了Aβ25-35誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞線粒體ROS產(chǎn)生的同時(shí)并降低GRP78、CHOP和caspase-12表達(dá),因此提示線粒體ROS介導(dǎo)的ERS在Aβ25-35誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用,與以往研究氧化還原信號(hào)傳導(dǎo)途徑支配ERS相一致[23,24]。

綜上所述,抑制MCU對(duì)Aβ誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,且氧化應(yīng)激介導(dǎo)的ERS可能在MCU參與Aβ25-35誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。