曹香玲，吳新貴，張俊川，周麗芳，劉建偉

缺血性卒中不僅造成大腦神經(jīng)功能缺損，還能造成其他系統(tǒng)嚴(yán)重的并發(fā)癥。研究表明，缺血性卒中常會繼發(fā)心臟、腎臟等臟器損害[1,2]，引起心肌組織出血、缺血、腎臟組織腫脹變性及低灌注性損傷[3,4]。在腦梗死臨床治療中，更多的集中在減輕腦損傷及神經(jīng)功能缺損康復(fù)方面，而針對其它腦梗死并發(fā)癥特別是腎損傷的重視程度、治療和研究較少，因此在促進(jìn)腦梗死患者神經(jīng)功能恢復(fù)的同時(shí)，針對其并發(fā)癥的治療也十分重要，這直接影響到患者受損神經(jīng)功能的近期及遠(yuǎn)期恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)通過觀察急性腦梗死大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎臟形態(tài)和功能結(jié)構(gòu)的改變，了解急性腦梗死對腎臟的影響，為卒中后繼發(fā)腎損傷的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 挑選SPF級健康雄性SD大鼠48只，平均體重(270±50)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2014-0002。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK(桂)2014-0003。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組，每組再隨機(jī)分為1 d、3 d、7 d、14 d 4個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。

1.2 方 法

1.2.1 建立腦梗死模型 模型組采用改良Longa線栓法[5]，制備右側(cè)大腦中動(dòng)脈梗死(MCAO)大鼠模型。以10%腹腔注射(35 mg/kg劑量)麻醉大鼠，將大鼠仰臥固定，頸部消毒后正中切開，鈍性分離暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ICA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ECA)，在血管下方分別放置絲線并用止血鉗固定，以懸掛絲線的方式三方反向牽引，暫時(shí)阻斷CCA、ICA、ECA血流，在距ICA分叉5 mm處，用微型眼科剪剪開CCA上1/3動(dòng)脈壁，插入線栓，沿ICA向上平行推進(jìn)(19±0.5)mm，結(jié)扎ICA，并于血管剪開口處前后結(jié)扎CCA以固定線栓、止血，消毒后逐層縫合切口。假手術(shù)組大鼠只分離右側(cè)CCA、ICA、ECA，不插線栓不結(jié)扎，消毒后縫合切口。術(shù)中及術(shù)后注意大鼠保溫。

1.2.2 模型納入標(biāo)準(zhǔn) 急性MCAO大鼠模型制備參考Bederson 4分5級法[6]在大鼠手術(shù)蘇醒后24 h內(nèi)，出現(xiàn)以下任意兩項(xiàng)即為造模成功：(1)左側(cè)肢體疼痛刺激后收縮現(xiàn)象消失；(2)向左傾倒或轉(zhuǎn)圈；(3)提尾時(shí)左上肢屈曲抱胸，不能向前伸直。

1.2.3 標(biāo)本采集 兩組大鼠分別在1 d、3 d、7 d、14 d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取6只，麻醉成功后仰臥固定，將大鼠沿腹部正中線由會陰上方至膈肌剪開，完全暴露腹部臟器，快速找到腹主動(dòng)脈，采集腹主動(dòng)脈血4 ml，室溫下靜置2 h后，4 ℃ 3000/min離心10 min取上清液，全自動(dòng)生化分析儀常規(guī)測定Cr、BUN、Cys C含量；放血處死大鼠后，剪去左腎組織，生理鹽水清洗血漬，放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE、Masson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟結(jié)構(gòu)形態(tài)的改變。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠急性腦梗死模型評價(jià) 模型組大鼠術(shù)后第一天精神煩躁，原地追尾轉(zhuǎn)圈，隨著時(shí)間延長，大鼠右側(cè)瞳孔縮小、眼瞼下垂、眼球內(nèi)陷，甚至少量血漬，出現(xiàn)Honer癥；精神逐漸變差，萎靡，倦怠，活動(dòng)減少，行動(dòng)遲緩，弓背滯伏，進(jìn)食、進(jìn)水、排尿減少，大便質(zhì)硬干結(jié)，量少；皮毛色澤晦暗、易掉毛，體型逐漸消瘦，術(shù)后6 d～7 d時(shí)，大鼠體重不再下降，精神較前稍好轉(zhuǎn)，少量進(jìn)食，但仍活動(dòng)較少，身體易左側(cè)傾倒。假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)上述神經(jīng)缺損癥狀，攝水飲食正常，可排除腦梗死。

2.2 大鼠腎組織病理學(xué)改變 肉眼觀察，假手術(shù)組大鼠的腎臟形態(tài)及大小正常，顏色潤澤；模型組大鼠，1 d、3 d時(shí)腎臟腫脹，色澤暗紅，7 d及14 d時(shí)部分大鼠腎臟組織體積縮小，顏色暗紅，腎臟表面散在少量出血點(diǎn)。

2.2.1 HE染色 假手術(shù)組大鼠腎組織切片各時(shí)間段結(jié)構(gòu)清晰，無細(xì)胞腫脹、充血，腎小管管腔完整，腎小球形態(tài)正常；模型組第一天、第3天腎組織的病理變化不明顯，偶見腎小管上皮細(xì)胞腫脹，腎小球未見明顯改變，第7天、第14天鏡下可見部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫、空泡化、刷狀緣消失，部分腎小球出現(xiàn)萎縮(見圖1)。

A：假手術(shù)組；B：模型組3 d；C：模型組7 d；D：模型組14 d圖1 各組大鼠術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d時(shí)腎組織HE染色(×200)

2.2.2 Masson染色 假手術(shù)組1 d、3 d、7 d、14 d各切片結(jié)構(gòu)清晰，腎小管胞質(zhì)、紅細(xì)胞呈暗紅色；模型組第一天、第3天腎組織未見明顯病理變化，第7天、14天鏡下可見部分腎小管上皮細(xì)胞附近出現(xiàn)綠色淡染，表明腎小管間質(zhì)出現(xiàn)少量膠原纖維(見圖2)。

A：假手術(shù)組；B：模型組3 d；C：模型組7 d；D：模型組14 d圖2 各組大鼠術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d時(shí)腎組織Masson染色(×200)

2.3 大鼠血中Cr、BUN、Cys C濃度變化 大鼠腦梗死后1 d血清中Cr、BUN濃度有升高，但與假手術(shù)組(A組)比差異不顯著(P>0.05);而腦梗死后3 d、7 d、14 d時(shí)Cr、BUN濃度明顯升高,與假手術(shù)對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組(B組)內(nèi)Cr濃度術(shù)后14 d和1 d、3 d、7 d比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組內(nèi)BUN濃度術(shù)后7 d和1 d、3 d、14 d比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；血清Cys C含量在腦梗死術(shù)后3 d明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組內(nèi)Cys C術(shù)后3 d和1 d、7 d、14 d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示大鼠急性腦梗死后腎功能受損(見表1)。

表1 各時(shí)間點(diǎn)大鼠血清Cr、BUN、Cys C濃度變化

與假手術(shù)組相比*P>0.05；與假手術(shù)組相比#P<0.05

3 討 論

急性腦梗死(acute cerebral infarction，ACI)可誘發(fā)多系統(tǒng)并發(fā)癥，急性腎損傷是常見并發(fā)癥之一，腦梗死急性期伴發(fā)腎臟高灌注，損害腎小球基底膜，尿蛋白增多，隨著腎小球?yàn)V過率下降，腎功能指標(biāo)血清UA、Cr、BUN、CysC水平升高[7～9]。腎損傷后導(dǎo)致的水鈉代謝紊亂、酸中毒及氮質(zhì)代謝產(chǎn)物的積聚可導(dǎo)致患者神志淡漠或煩躁、抽搐、昏迷等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的加重，甚至造成并發(fā)癥死亡。因此，卒中后評估并采取必要措施保護(hù)腎功能是降低急性卒中患者院內(nèi)死亡風(fēng)險(xiǎn)的先決條件，這也直接影響到患者受損的神經(jīng)功能的近期及遠(yuǎn)期恢復(fù)。因此，在治療急性腦梗死神經(jīng)功能缺損的同時(shí)，針對腎損傷的治療有其重要意義。

本實(shí)驗(yàn)通過腎組織HE及Masson染色觀察發(fā)現(xiàn)，ACI大鼠腎臟組織在第1天、第3天時(shí)可見少量腎小管上皮細(xì)胞腫脹；在第7天時(shí)出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞水腫、壞死、刷狀緣消失；第14天時(shí)損傷持續(xù)加重，說明腦梗死大鼠腎組織存在實(shí)質(zhì)性的損傷，這與前人觀察大鼠腦梗死會引起腎組織損傷結(jié)果相一致。張新江等[10]發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注6 h時(shí)大鼠腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)渾濁腫脹；24 h后觀察到腎小球毛細(xì)血管腔閉鎖，體積縮小，遠(yuǎn)曲小管和集合管上皮細(xì)胞廣泛壞死[11]。伍麗娜等[12]在大鼠腦缺血再灌注后2 h、24 h、48 h時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞水腫，并有核固縮的表現(xiàn)，伴炎性細(xì)胞浸潤,其他研究同樣發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后大鼠腎小管上皮細(xì)胞變性，有蛋白管型[13]。以上實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間多在72 h內(nèi)，而隨著腦梗死時(shí)間的延長，腎組織形態(tài)及功能改變未做持續(xù)研究。本實(shí)驗(yàn)與以往研究相比，持續(xù)動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)后期腎組織表面有散在出血點(diǎn)，腎組織出現(xiàn)纖維化，腎功能生化指標(biāo)持續(xù)升高，表明腎組織存在損傷，且隨時(shí)間的延長，損傷逐漸加重。

腎小球?yàn)V過、重吸收功能下降，會引起Cr、BUN濃度升高，而CysC血清濃度與腎功能損害程度高度相關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，模型組Cr濃度第1天、第3天差異不顯著；至第7天、第14天出現(xiàn)明顯上升，術(shù)后模型組大鼠CysC、BUN濃度持續(xù)升高并分別在術(shù)后第3天、第7天達(dá)到峰值，而由此我們推測腦梗死急性期身體處于“應(yīng)激”狀態(tài)，會引起腎素-血管緊張素等過度分泌，導(dǎo)致腎臟血管劇烈收縮，血管痙攣供血不足而缺氧，當(dāng)血管重新開放又引起腎缺血再灌注損傷，腎血漿流量及腎排泄濾過能力下降，Cr、BUN不能順利隨尿排出[14],從而出現(xiàn)血內(nèi)肌酐、尿素氮、胱抑素C的持續(xù)升高[15,16]，同時(shí)也表明卒中后引起腎組織的持續(xù)性損傷。隨后CysC濃度逐漸降低，可能是因?yàn)镃ysC作用于半胱氨酸的巰基，對半胱氨酸酶的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，對缺血性腦卒中起腦保護(hù)作用，與趙德強(qiáng)等[17]觀察缺血性腦卒中患者血清CysC變化的結(jié)果相一致。本研究病理結(jié)果顯示腦梗死術(shù)后1 d、3 d時(shí)腎組織損傷不明顯,而損傷初期尿素氮顯著升高，不排除腦梗死初期尿素氮濃度與外源性(蛋白質(zhì)攝入量)、內(nèi)源性(感染、腎上腺皮質(zhì)激素的應(yīng)用、胃腸出血等)尿素負(fù)荷的大小有關(guān)[18]。這些不確定因素都會導(dǎo)致尿素氮的水平不穩(wěn)定，故我們推測本實(shí)驗(yàn)中BUN濃度在初期升高可能和應(yīng)激反應(yīng)、炎癥等內(nèi)源性反應(yīng)有關(guān)，導(dǎo)致腎功能上的損傷；在第14天降低可能與大鼠后期飲食、飲水量的改變等外源性因素有關(guān)。

急性腦梗死后根據(jù)腎損傷的發(fā)病原因，臨床上將其分為內(nèi)源致病因素和外源致病因素，外源致病因素主要是對比劑、甘露醇及溶栓治療等引起的腎損傷；內(nèi)源致病因素導(dǎo)致的腎損傷為腦部病變直接引起的急性腎損傷[19]，可能因缺血后腦缺血和水腫引起神經(jīng)內(nèi)分泌功能紊亂、交感神經(jīng)興奮、腎素-血管緊張素分泌增加、腎血管舒張功能障礙，從而造成腎小管缺血性壞死[20]。同時(shí)，腦損傷導(dǎo)致機(jī)體應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[21]，引起有害物質(zhì)代謝能力下降，而炎癥因子激活免疫細(xì)胞和產(chǎn)生活性氧，可直接引起腎組織細(xì)胞損傷和腎血管痙攣，進(jìn)一步加重腎損傷，導(dǎo)致神經(jīng)源性腎功能障礙或急性腎衰竭[22,23]。此外，卒中可導(dǎo)致機(jī)體血容量下降，腎血管灌流不足，腎小球?yàn)V過率下降，引起腎前性AKI[24]。本研究中模型組Cr、BUN、CysC維持較長時(shí)間的高數(shù)值，提示腦梗死對腎功能的損傷是持續(xù)的，臨床中對腦梗死的治療應(yīng)在卒中早期注意保護(hù)腎功能，避免腎性缺血，同時(shí)持續(xù)改善腦缺血，減輕神經(jīng)內(nèi)分泌功能紊亂，減輕內(nèi)源性腎功能損害。本實(shí)驗(yàn)中不足之處未記實(shí)驗(yàn)大鼠尿量及測定24 h尿蛋白，不能精確測定大鼠尿量改變；同時(shí)未設(shè)置治療組，未進(jìn)行卒中后腎功能損傷的針對性治療，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)我們將會進(jìn)一步設(shè)置治療組，探索有效的治療方法，為臨床急性腦梗死后腎功能的改善提供治療依據(jù)。