任勇

(淄博師范高等專科學(xué)校數(shù)理科學(xué)系，山東淄博 255130)

0 引言

自1983年，世界上首次報(bào)道轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品以來(lái)，轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的推廣，對(duì)解決一些貧困和落后地區(qū)的糧食危機(jī)、營(yíng)養(yǎng)不良等系列問(wèn)題發(fā)揮了重要作用.但隨著其日益深入人們的生活，特別是全球范圍內(nèi)出現(xiàn)的多起由轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品引起的環(huán)境、食品、人類遺傳等問(wèn)題，在世界范圍內(nèi)引起了廣泛關(guān)注，迫切需要可靠地技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析和檢測(cè).DNA電化學(xué)生物傳感器是一種生命科學(xué)、材料科學(xué)、信息技術(shù)等多種學(xué)科相互交叉滲透的高新技術(shù)，具備分析速度快、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，在DNA特定序列檢測(cè)、基因篩選、食品安全等方面有廣闊的應(yīng)用前景[1-5]，目前已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)分析的一項(xiàng)核心技術(shù).

在眾多關(guān)于DNA電化學(xué)生物傳感器的研究中，如何使ssDNA探針有序、穩(wěn)定的固定在電極表面始終是研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，因?yàn)槠涔潭〝?shù)量和牢固程度將直接影響傳感器的穩(wěn)定性、靈敏度和使用壽命.目前，DNA探針的固定方法有表面吸附法[6]，共價(jià)鍵合法[7-9]，LB膜技術(shù)[10]，生物素-親和素法[11]，電聚合法[12]等.近年來(lái)，關(guān)于在殼聚糖膜上固定DNA已有研究.殼聚糖是一種天然的陽(yáng)離子聚合物，具有極好的成膜能力和分散性，被廣泛應(yīng)用于電極修飾測(cè)定多種物質(zhì)[13-14]，尤其是其氨基可以和DNA的磷酸基團(tuán)形成一種緊密絡(luò)合物，固定的DNA探針較為牢固.例如，徐春等[15]曾在鉑電極上通過(guò)殼聚糖固定DNA探針，所制得的電化學(xué)傳感器對(duì)cDNA序列具有較高的選擇性；蘇會(huì)嵐等[16]把殼聚糖膜納米復(fù)合物修飾于玻碳電極表面制得的電化學(xué)傳感器用以檢測(cè)mir-21時(shí)效果良好；Kara等[17]以亞甲基藍(lán)(MB)為指示劑，測(cè)定了DNA探針在殼聚糖修飾電極上雜交前后電化學(xué)信號(hào)的變化，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了殼聚糖與DNA的磷酸骨架有較強(qiáng)的結(jié)合能力.Wang等[18]將ssDNA探針固定在修飾有殼聚糖多壁碳納米管的玻碳電極表面，制備的納米組合膜電極檢測(cè)效果良好.本實(shí)驗(yàn)將十八碳酸作為修飾劑改良了碳糊電極表面性質(zhì)，通過(guò)電極表面富含的羧基與殼聚糖之間的靜電作用自組裝一層殼聚糖膜，利用殼聚糖與DNA的絡(luò)合作用固定DNA探針，用循環(huán)伏安法對(duì)DNA的固定和雜交條件進(jìn)行了優(yōu)化分析，測(cè)定了不同修飾電極的表觀電容，并對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜的外源NPT II基因片段進(jìn)行了檢測(cè).

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 主要儀器與試劑：

CHI 832電化學(xué)分析儀(上海辰華儀器公司)，三電極系統(tǒng)：DNA修飾碳糊電極為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑絲為對(duì)電極；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠)；pHS-25型pH計(jì)(上海雷磁儀器廠).

殼聚糖購(gòu)于上海未來(lái)實(shí)業(yè)有限公司，NPT II基因序列20堿基寡聚核苷酸片段購(gòu)自北京SBS基因技術(shù)有限公司，各基因片段的堿基序列如下：

20堿基DNA探針 (ssDNA): 5'- GCA TCG AGC GAG CAC GTA CT -3'

目標(biāo)基因，即轉(zhuǎn)基因油菜外源NPT II基因的20堿基單鏈DNA片段，為DNA探針互補(bǔ)DNA(cDNA): 5'- AGT ACG TGC TCG CTC GAT GC -3'

2-堿基錯(cuò)配DNA (2-base mismatch DNA): 5'- AGT ATG TGC TCG CTC GTT GC -3',其中，2-堿基錯(cuò)配DNA序列的錯(cuò)配堿基已用下劃線標(biāo)出.

非互補(bǔ)DNA (ncDNA): 5'- CTT CTA CAT CTG GAG TGC TA -3'

其他化學(xué)試劑均為分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 殼聚糖膜修飾電極制備

將殼聚糖溶解在1%的冰醋酸溶液中，25攝氏度超聲至殼聚糖全部溶解均勻，備用.在拋光后的電極表面滴5 μL 0.5%的殼聚糖溶液，自然風(fēng)干.然后將制得的電極置于pH 7.0 TE溶液中浸泡30 min，去除殼聚糖膜中的醋酸，即得殼聚糖膜修飾電極，記為chi/CPE.

1.2.2 DNA修飾電極的制備與雜交

將chi/CPE電極置于1.0×10-5mol/L的ssDNA溶液中，25攝氏度下自然富集20 min，然后分別在pH 7.0 TE緩沖溶液、蒸餾水內(nèi)清洗5 min，自然晾干，制得探針修飾電極，記為ssDNA/chi/CPE.

在+0.4 V電位下，把上述制備的ssDNA/chi/CPE與靶DNA(cDNA)雜交5 min，然后分別在pH 7.0 TE緩沖溶液、蒸餾水內(nèi)清洗5 min，自然晾干，制得雙鏈DNA修飾電極，記為dsDNA/chi/CPE.為說(shuō)明殼聚糖在固定ssDNA探針過(guò)程中的作用，本實(shí)驗(yàn)把ssDNA在未組裝殼聚糖膜的碳糊電極上的固定、雜交作為對(duì)比實(shí)驗(yàn).

2 討論

2.1 MB在各修飾電極上的循環(huán)伏安行為

圖1為用循環(huán)伏安法測(cè)得的1.5 × 10-5mol/L MB在不同修飾電極上的氧化還原峰電流訊號(hào).

圖1 MB在不同修飾碳糊電極上的循環(huán)伏安曲線，掃描速率：100 mV/s

曲線1為MB在CPE電極上的峰電流訊號(hào)，還原峰電位Epc在-0.227V，氧化峰電位Epa在-0.185 V，峰電位差(ΔEp)為0.042V，表現(xiàn)出良好的可逆性.曲線2為MB在chi/CPE上的峰電流訊號(hào)，還原峰電位Epc在-0.218V，氧化峰電位Epa在-0.156 V，ΔEp為0.062V，較比CPE有較大增加，說(shuō)明其可逆性變差.同時(shí)，其還原峰電流ipc和氧化峰電流ipa分別較曲線1均有較大的降低，說(shuō)明殼聚糖成功修飾到了CPE電極表面導(dǎo)致其表面性質(zhì)發(fā)生了變化.這是因?yàn)椋緦?shí)驗(yàn)在制備碳糊電極時(shí)，把十八碳酸作為電極修飾劑，從而使制得的電極表面富含羧基.由于羧基帶負(fù)電荷，指示劑MB陽(yáng)離子帶正電荷，二者之間的靜電作用使較多的MB在碳糊電極表面發(fā)生反應(yīng)，從而表現(xiàn)出較大反應(yīng)電流和較好的可逆性.而當(dāng)在碳糊電極表面組裝殼聚糖膜后，由于殼聚糖是一種天然的陽(yáng)離子聚合物，與MB陽(yáng)離子之間存在靜電排斥作用，導(dǎo)致MB陽(yáng)離子不易在電極表面富集，故電化學(xué)反應(yīng)可逆性變差，氧化還原電流變小.

曲線3為MB在ssDNA/chi/CPE上的氧化還原峰電流訊號(hào)，比MB在chi/CPE的電流信號(hào)增大很多，證明ssDNA探針在chi/CPE上固定效果較好.這是因?yàn)闅ぞ厶堑陌被梢院虳NA的磷酸基形成一種緊密的絡(luò)合物，殼聚糖膜以此方式使ssDNA探針固定在chi/CPE電極表面.由于ssDNA探針的自由堿基G與MB有很強(qiáng)的親和力，在固定到chi/CPE電極表面后其自由堿基G暴露在外，極易與MB發(fā)生親和作用，所以MB在ssDNA/chi/CPE上的電化學(xué)信號(hào)最為顯著[19-21].觀察其峰電位，Epc在-0.223V，Epa在-0.178 V，峰電位差(ΔEp)為0.045V，可逆性與曲線1接近.

曲線4為MB在ssDNA/chi/CPE電極與cDNA雜交后所得dsDNA/chi/CPE電極上的氧化還原峰電流訊號(hào).曲線4的峰電流較曲線3有顯著降低，但仍大于曲線2的峰電流，說(shuō)明ssDNA/chi/CPE電極表面的ssDNA與cDNA發(fā)生雜交得到了dsDNA.峰電流減小的原因在于MB與單、雙鏈DNA結(jié)合方式不同.雜交后，G堿基被包埋在dsDNA雙螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)部，而不是像在ssDNA中的G堿基暴露于外，MB與dsDNA的嵌插作用小于MB與ssDNA的G堿基的特異性親和力，故曲線4的氧化還原峰電流較曲線3有明顯降低.但由于MB與dsDNA的嵌插作用，故MB在dsDNA/chi/CPE電極上的峰電流仍然大于在chi/CPE電極上的峰電流.

對(duì)比實(shí)驗(yàn)采用在不修飾殼聚糖膜的CPE電極上進(jìn)行ssDNA的固定和雜交，并在相同條件下測(cè)量MB在CPE、ssDNA/ CPE、dsDNA/ CPE上的電化學(xué)信號(hào).結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MB在ssDNA/ CPE、dsDNA/ CPE上的氧化還原峰電流與在CPE上相比基本沒(méi)有變化，說(shuō)明，ssDNA探針不能在十八碳酸碳糊電極上直接固定.

2.2 修飾電極表觀電容的測(cè)定

電極的表觀電容是說(shuō)明電極表面性質(zhì)的一個(gè)重要參數(shù).在1.0 mol/L KNO3溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃描范圍為+0.40 V 至+0.60 V (vs.SCE)，記錄在不同掃描速度(v，v<100 mV/s)下+0.5 V處的電容電流密度(jc).將jc對(duì)掃描速度作圖，所得直線斜率即為電極的表觀電容[22].各電極的表觀電容見(jiàn)表1.

表1 實(shí)驗(yàn)測(cè)得的不同修飾電極的表觀電容

由表中數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，chi/CPE電極的表觀電容小于CPE的表觀電容.這是因?yàn)椋?/p>

C-1= d /εε'

式中，C為電極表觀電容，d為電極表面電介質(zhì)的厚度，ε為電介質(zhì)的介電常數(shù)(電容率)，ε'為自由空間的介電常數(shù).由公式可知，表觀電容反比于電極表面電介質(zhì)的厚度；同時(shí)，表觀電容會(huì)因?yàn)樵陔姌O表面形成電雙層而變大.當(dāng)在電極表面組裝殼聚糖膜后，電極表面電介質(zhì)厚度(d)的增大導(dǎo)致了電極表觀電容的降低；而在此殼聚糖膜上繼續(xù)固定DNA探針后，由于在ssDNA/chi/CPE電極表面形成了電雙層，因而DNA探針修飾電極的表觀電容變大，甚至大于CPE電極表面的表觀電容.這也從另一個(gè)方面證明，ssDNA探針可以很好的固定在殼聚糖膜電極表面.

2.3 DNA固定條件的優(yōu)化

2.3.1 CPE組成的選擇

碳糊電極因其制作簡(jiǎn)單、成本低廉、容易改良等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于生物傳感器研究.為了增強(qiáng)殼聚糖在電極表面的穩(wěn)定性，本文把十八碳酸作為修飾劑和粘合劑制備碳糊電極.實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)石墨粉、石蠟和十八碳酸的比例為9:2:1時(shí)，殼聚糖在電極表面的自組裝膜性能穩(wěn)定，不易脫落，固定的ssDNA 探針比較牢固，并且經(jīng)拋光重復(fù)利用時(shí)性能穩(wěn)定，測(cè)量數(shù)據(jù)偏差小.

2.3.2 殼聚糖濃度的優(yōu)化

在本研究中，殼聚糖在碳糊電極表面的自組裝成膜以及對(duì)ssDNA 探針的固定是核心內(nèi)容，而殼聚糖濃度是影響其自組裝成膜的重要因素.研究發(fā)現(xiàn)，在0.1%至0.5 %濃度范圍內(nèi)，殼聚糖濃度越大，MB在chi/CPE上的電化學(xué)信號(hào)持續(xù)變小，但超過(guò)0.5 %濃度后，減小的非常緩慢.說(shuō)明當(dāng)殼聚糖濃度在0.5 %時(shí)，其在碳糊電極表面的成膜效果最好.同樣，在0.1%至0.5 %濃度范圍內(nèi)，殼聚糖濃度越大，MB在ssDNA/chi/CPE上的電化學(xué)信號(hào)持續(xù)變大，但超過(guò)0.5 %濃度后，增加的非常緩慢.說(shuō)明，當(dāng)chi濃度為0.5%時(shí)，chi/CPE對(duì)ssDNA 探針的固定效果最佳[23](P50).綜合上述殼聚糖濃度對(duì)在電極表面自組裝成膜和對(duì)ssDNA 探針的固定兩方面的考慮，本研究所用殼聚糖濃度選擇0.5 %.

2.3.3 雜交時(shí)間的選擇

ssDNA/chi/CPE與cDNA的雜交時(shí)間是影響檢測(cè)結(jié)果的重要因素.本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了ssDNA/chi/CPE與cDNA不同雜交時(shí)間的電化學(xué)信號(hào)，并以MB為指示劑對(duì)結(jié)果進(jìn)行表征，如圖2所示.

圖2 雜交時(shí)間對(duì)雜交效果的影響

實(shí)驗(yàn)表明，在0到5min范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，峰電流逐漸降低，說(shuō)明雜交逐步進(jìn)行.當(dāng)雜交時(shí)間超過(guò)5min時(shí)，峰電流有增大趨勢(shì)，說(shuō)明雜交完成后，MB與DNA磷酸骨架的吸附作用逐漸增強(qiáng)，會(huì)影響檢測(cè)效果.故選擇5min為本實(shí)驗(yàn)的雜交時(shí)間.

2.4 探針修飾電極的穩(wěn)定性的研究

按照本研究所述方法同時(shí)制備30支ssDNA/chi/CPE修飾電極，按照10支一組分成三組，分別置于2 mL pH 6.0的B-R緩沖溶液、2 mL pH7.0磷酸鹽緩沖溶液、2 mL 2×SSC緩沖溶液中，30℃下靜置3 h后，將各組電極分別轉(zhuǎn)移至1.5×10-5mol/L MB溶液中，分別用循環(huán)伏安法測(cè)量MB在各支探針修飾電極上的氧化還原峰電流，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)浸泡后，各支電極的氧化還原峰電流均未減?。辉僖宰贤夤庾V法對(duì)三組浸泡ssDNA/chi/CPE電極的溶液進(jìn)行定性分析(因?yàn)橐恢щ姌O上固定的ssDNA量較少，所以用平行制得的多支電極同時(shí)浸泡)，在260 nm處沒(méi)有觀察到DNA的紫外吸收峰，說(shuō)明溶液中沒(méi)有DNA[23](P67).上述兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均證明，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間浸泡后，沒(méi)有ssDNA探針從ssDNA/chi/CPE修飾電極上脫落，說(shuō)明通過(guò)殼聚糖膜固定的ssDNA探針?lè)浅７€(wěn)定，能對(duì)互補(bǔ)的ssDNA序列進(jìn)行檢測(cè).

2.5 轉(zhuǎn)基因油菜外源基因片段的檢測(cè)

圖3為用本實(shí)驗(yàn)制得的傳感器在pH 6.0 B-R緩沖溶液中，以1.5×10-5mol/L MB為指示劑，用微分脈沖伏安法測(cè)定轉(zhuǎn)基因油菜外源基因片段結(jié)果.

圖3 微分脈沖伏安法檢測(cè)合成轉(zhuǎn)基因油菜外源NPT II基因片段

曲線1為MB在chi/CPE上的微分脈沖伏安曲線.由于殼聚糖與MB陽(yáng)離子之間的靜電排斥作用，故峰高最小.相比曲線1，MB在固定轉(zhuǎn)基因油菜外源NPT II基因片段的ssDNA/chi/CPE上得到最大的峰高如曲線2，其峰電位在-0.186 V，說(shuō)明NPT II基因片段的ssDNA探針成功固定在chi/CPE電極表面.按照本研究所述方法，將固定有NPT II基因片段的ssDNA探針修飾電極與其cDNA雜交后，再以微分脈沖伏安法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)得到曲線3，其峰高顯著降低，且三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.說(shuō)明，該傳感器能實(shí)現(xiàn)對(duì)NPT II基因片段互補(bǔ)序列的有效檢測(cè).

在同樣雜交條件下，分別用非互補(bǔ)的20堿基的ssDNA、2-堿基錯(cuò)配ssDNA代替NPT II基因互補(bǔ)序列作為對(duì)比實(shí)驗(yàn)，用微分脈沖伏安法檢測(cè)分別得到曲線4、曲線5 .比較曲線4和曲線2的峰高可知，固定有NPT II基因片段的ssDNA探針修飾電極與非互補(bǔ)的ssDNA基本沒(méi)有發(fā)生雜交；比較曲線5和曲線2的峰高可知，固定有NPT II基因片段的ssDNA探針修飾電極與2-堿基錯(cuò)配ssDNA發(fā)生了部分雜交.實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，此傳感器既可識(shí)別NPT II基因片段，同時(shí)對(duì)其堿基錯(cuò)配序列和非互補(bǔ)ssDNA序列也具有較好的識(shí)別能力[23](P57).

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)制得的十八碳酸碳糊電極與殼聚糖膜結(jié)合緊密，通過(guò)殼聚糖膜固定的 DNA探針牢固，對(duì)其互補(bǔ)DNA序列有較好的檢測(cè)識(shí)別功能，說(shuō)明殼聚糖是一種理想的電極表面修飾物質(zhì).相比前期關(guān)于生物傳感器的系列研究，通過(guò)殼聚糖膜制備的傳感器比通過(guò)金屬離子膜制備的傳感器電化學(xué)信號(hào)較強(qiáng)，MB在不同階段的修飾電極上電化學(xué)信號(hào)變化明顯，說(shuō)明chi/CPE較Al3+/CPE修飾電極在DNA探針的固定和檢測(cè)方面具備優(yōu)勢(shì)，為生物傳感器的深入研究拓寬了材料選擇范圍.研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)用到的溶液PH值、指示劑的選擇及濃度、掃描速率等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果都有一定的影響.下一步要優(yōu)化各種實(shí)驗(yàn)條件，在傳感器的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性方面進(jìn)行深入研究.