王歡歡，黃曉舞，白 林（中國人民解放軍總醫(yī)院制劑中心，北京 100853）

利咽含片是解放軍總醫(yī)院非標(biāo)準(zhǔn)制劑品種，處方由青果、金銀花、薄荷腦等組成，具有清熱解毒，消腫止痛，化痰止咳，生津潤燥的作用。用于肝腎陰虛型慢性咽喉炎引起的咽喉腫痛，干咳無痰，咽干喑啞等癥。臨床使用多年，質(zhì)量可靠，療效安全。該制劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)較低，沒有含量測定項，為了更好的控制其內(nèi)在質(zhì)量，本研究采用HPLC法對利咽含片中綠原酸含量進(jìn)行測定，旨為更好地控制利咽含片的質(zhì)量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

XS105型電子天平（梅特勒精密儀器有限公司）；Agilent 1260液相色譜儀（美國Agilent公司）；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；列孔型電熱恒溫水浴鍋（天津市中環(huán)科技開發(fā)公司）。

1.2 材料

利咽含片（解放軍總醫(yī)院，批號：LYP170401、LYP170501、LYP170502、LYP170503）；綠原酸對照品（批號：110753-201716）購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為高純水，硅膠G板（青島海洋化工廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗[1]

色譜柱：Agilent EclipseXDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：327 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于1000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取綠原酸對照品（批號：110753-201716，含量按99.3%計）10.06 mg置50 mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為儲備液。精密量取儲備液5 mL，置25 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL含39.96 μg的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取利咽含片（批號：LYP170401），研細(xì)，取約0.45 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理20 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 取缺少金銀花和桑葚藥材的陰性樣品，按“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.3 專屬性實驗

取上述對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果顯示，供試品中綠原酸與對照品在相同保留時間處有相同色譜峰，峰形良好，與其他組分峰基線分離度較好，且陰性樣品無干擾。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取儲備液適量，分別加50%甲醇稀釋配成不同濃度的對照品溶液。分別精密量取儲備液和不同濃度對照品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得綠原酸回歸方程：Y= 5.561 26×105X- 4.593 85×105（r= 0.999 9）。結(jié)果表明：綠原酸的濃度在9.989 6 ～199.791 6 μg·mL-1范圍內(nèi)峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度實驗

取綠原酸對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，綠原酸峰面積的RSD為0.15%（n= 6），表明儀器精密度良好。

圖1 綠原酸高效液相色譜圖A - 供試品，B - 綠原酸對照品，C - 陰性對照；1 - 綠原酸Fig 1 HPLC chromatograms of chlorogenic acid A - test samples, B - chlorogenic acid control, C - negative control;1 - chlorogenic acid

2.6 重復(fù)性實驗

精密稱取利咽含片（批號：LYP170401）供試品6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果顯示，綠原酸含量平均值為每片5.89 mg，RSD為0.17%（n= 6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 中間精密度實驗

取利咽含片（批號：LYP170401）細(xì)粉適量，在不同時間，由不同的實驗人員，使用不同型號高效液相色譜儀，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果表明，含量測定中間精密度實驗RSD值為1.11%（n= 6），表明該方法測定本品含量時中間精密度良好。

2.8 回收率實驗

精密稱取利咽含片（批號：LYP170401）細(xì)粉約0.22 g，置具塞錐形瓶中，加入濃度為42.222 4 μg·mL-1的綠原酸對照品溶液25 mL，再精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得，平行制備6份供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 回收率測定結(jié)果. n = 6Tab 1 Results of recovery tests. n = 6

2.9 穩(wěn)定性實驗

取“2.2.2”項下供試品溶液，室溫放置，分別于0、3、6、9、13、16、19、21、24、27 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，綠原酸峰面積RSD為0.53%（n= 10），結(jié)果表明供試品溶液在室溫放置27 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 樣品中綠原酸含量測定

取三批中試樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果. n = 3Tab 2 Results of content determination of samples. n = 3

3 討論

3.1 專屬性考察[2-3]

在含量測定專屬性實驗中，分別取處方中各藥材細(xì)粉約0.5 g，置具塞錐形瓶中，按照供試品處理方法制備各藥材溶液，按“2.1”項下色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果桑葚溶液中在與對照品色譜峰相應(yīng)的位置有相同色譜峰，表明桑葚藥材中也含有綠原酸，故制備缺少金銀花及桑葚兩味藥材的陰性對照溶液，測定利咽含片中金銀花及桑葚兩味藥材中總的綠原酸含量。

3.2 提取方法和時間考察[4-7]

在供試品制備過程中，比較了甲醇和50%甲醇兩種提取溶劑，結(jié)果顯示50%甲醇提取效果較好。故確定本品溶劑為50%甲醇。同時考察了不同提取時間（20 min、30 min、40 min）對含量的影響，結(jié)果表明超聲提取20 ～ 40 min時供試品中綠原酸含量基本一致，故確定本品提取時間為20 min。

3.3 流動相考察[1]

參照《中國藥典》（2015年版）一部金銀花藥材標(biāo)準(zhǔn)，以乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87）為流動相，結(jié)果表明供試品中綠原酸峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度達(dá)不到要求，通過試驗，以乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90）為流動相，供試品中綠原酸峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度可達(dá)到要求。故確定本品流動相為乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90）。

3.4 系統(tǒng)耐用性考察

為了考察微小變動因素對本品含量測定的影響，調(diào)節(jié)流速（0.9、1.0、1.1 mL·min-1）、柱溫（25、30、35 ℃）和流動相比例（8∶92、10∶90、12∶88）進(jìn)行試驗（RSD =0.36%，n= 7），結(jié)果表明，在測試條件有微小變動時，測定結(jié)果基本不受影響，此測試條件的耐用性良好。

3.5 含量限度考察

根據(jù)含量測定數(shù)據(jù)，結(jié)合大生產(chǎn)工藝因素及不同批次間藥材含量高低差異，以及成品片重差異合理范圍等影響含量變化的因素，為確保成品質(zhì)量，暫定本品每片含綠原酸（C16H18O9）不得少于2 mg。